胃癌患者Slingshot-1表达与预后的相关性研究

韩永军 牛福勇

陕西省榆林市第一医院胃肠外科1(719000) 普外科2

背景：Slingshot-1(SSH1)通过使肌动蛋白解聚因子丝切蛋白再激活在细胞迁移的调控中发挥重要作用，被认为与肿瘤进展有关。目的：探讨胃癌患者SSH1表达与预后的相关性。方法：纳入2012年1月—2015年12月在榆林市第一医院行胃癌根治手术的患者111例，部分患者术前于内镜下取病变黏膜活检标本，以real-time PCR和免疫组化法检测SSH1 mRNA和蛋白表达，并与非癌胃黏膜进行比较。以免疫组化法检测111例手术标本SSH1蛋白表达，分析其表达与胃癌临床病理特征和患者预后的相关性。同时对预后影响因素行单因素和多因素分析。结果：胃癌组织中的SSH1 mRNA表达显著高于对照组(P<0.05)，且可见SSH1蛋白表达。111例胃癌患者中71例(64.0%)癌组织中SSH1表达阳性，SSH1表达与淋巴结转移显著相关(P<0.05)，与其他肿瘤临床病理参数无明显相关性(P>0.05)。SSH1表达阳性患者中位总生存期显著短于SSH1表达阴性患者(25.60个月对35.40个月，P=0.010，HR=1.71，95% CI: 1.14～2.57)。Cox回归分析显示淋巴结转移和TNM分期为预后危险因素。结论：SSH1在胃癌组织中表达增高，并与预后不良有关，有望成为预测胃癌患者预后的生物学标记物。

Background:Slingshot-1 (SSH1) is involved in the regulation of cell migration by reactivating actin-depolymerizing factor/cofilin, and is considered to be associated with tumor progression.Aims:To explore the correlation between SSH1 expression and prognosis of patients with gastric cancer.Methods:A total of 111 gastric cancer patients receiving radical operation from Jan. 2012 to Dec. 2015 at the First Hospital of Yulin were enrolled. In some of the patients, endoscopic mucosal specimens were obtained preoperatively for detection of SSH1 mRNA and protein expressions by real-time PCR and immunohistochemistry, respectively. Gastric mucosal specimens obtained from non-gastric cancer patients were served as controls. Furthermore, surgical specimens were collected from all the 111 patients to determine the SSH1 protein expression by immunohistochemistry. The correlations of SSH1 expression with clinicopathological characteristics and prognosis were analyzed. Univariate and multivariate analyses were performed to identify the predictors of poor survival rate.Results:Expression of SSH1 mRNA in gastric cancer tissue was significantly higher than that in normal gastric mucosa (P<0.05). Protein expression of SSH1 could also be detected in gastric cancer tissue. In 111 gastric cancer patients, 71 (64.0%) were positive for SSH1 protein expression. SSH1 expression was correlated with lymph node metastasis (P<0.05), whereas no correlations were found between SSH1 expression and other clinicopathological parameters (P>0.05). The median overall survival of SSH1-positive patients was poorer than that of SSH1-negative patients (25.60 months vs. 35.40 months, P=0.010, HR=1.71, 95% CI: 1.14-2.57). Cox regression model revealed that lymph node metastasis and TNM staging were the predictors for poor prognosis in gastric cancer patients. Conclusions:SSH1 is up-regulated in gastric cancer tissue and is associated with a poor prognosis. It might be used as a biomarker for predicting the prognosis of gastric cancer patients.

胃癌为常见的恶性肿瘤，近年来其发病率呈不断上升趋势，在我国恶性肿瘤死因中居第二位[1-2]。胃癌传统的治疗方法包括手术、放疗、化疗等，然而治疗效果个体差异较大[3]。近年兴起的个体化医疗理念主张根据患者具体情况制订特异性的治疗方案，因此采用恰当手段在治疗早期准确预测患者预后具有重要意义。

Slingshot-1(SSH1) cDNA全长4 467 bp，广泛表达于心、脑、肾、甲状腺、小肠等不同组织器官，编码丝切蛋白(cofilin)特异性磷酸酶SSH。LIM激酶(LIMK)可使丝切蛋白末端第三位色氨酸磷酸化而失活，SSH则可通过去磷酸化使之再激活，激活的丝切蛋白通过抑制肌动蛋白丝聚合以及促进肌动蛋白丝解聚，参与细胞微丝骨架重排，因此SSH1通过丝切蛋白在细胞迁移的调控中发挥重要作用[4-6]，进而可能参与肿瘤细胞的侵袭和迁移。既往研究表明，LIMK/cofilin信号通路和SSH与人结直肠癌进展和化疗耐药有关[7]；在原发性乳腺癌中，SSH1L被认为在肿瘤转移中起关键作用[8]；90%的终末期胰腺癌组织存在SSH1L高表达，SSH1L/丝切因子信号通路与胰腺癌细胞的侵袭、迁移有关[9]。然而，目前尚未见关于SSH1在胃癌中表达及其意义的研究报道。本研究旨在探讨SSH1表达与胃癌临床病理特征和患者预后的相关性，为临床上采取更精准的治疗方案提供依据，从而优化临床决策。

材料与方法

一、病例资料

2012年1月—2015年12月在榆林市第一医院行胃癌根治手术的患者111例纳入研究。入组患者均为初次诊断，术前未接受放疗、化疗、靶向治疗等肿瘤相关治疗，术后采取卡培他滨+奥沙利铂方案化疗。20例胃癌患者术前行胃镜检查，取病变黏膜活检标本，保存于液氮中，用于后续实验；同期20例排除胃癌以及其他消化系统疾病、其他器官系统恶性肿瘤、肝肾功能异常、凝血功能异常等情况的住院患者的内镜胃黏膜活检标本作为对照。采集患者性别、年龄以及肿瘤部位、大小、病理类型、淋巴结转移情况、TNM分期等临床病理资料，并收集手术癌组织标本用于后续实验。

二、主要试剂

TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific)；Quant cDNA第一链合成试剂盒(碧云天生物技术)；Real Master Mix(SYBR Green)(Takara Bio Inc.)；SSH1抗体(Abcam plc.)；免疫组化检测SP试剂盒(广州市凯秀贸易有限公司)。

三、方法

1. Real-time PCR：胃黏膜组织标本在冷冻条件下迅速研磨为匀浆，以TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，以之为模板行PCR扩增。按Real Master Mix(SYBR Green)说明书配置反应体系，反应于ABI 7500实时荧光定量PCR系统中进行。引物序列：SSH1，F 5’-CAC AAG CAT GCA GGT GAT CT-3’，R 5’-TAT GTG CAT CCT TCC TGC TG-3’；GAPDH(内参)，F 5’-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3’，R 5’-GGG TCA TTG ATG GCA ACA ATA-3’。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。2-ΔΔCt法计算SSH1 mRNA相对表达量。

2. 免疫组化染色：组织块梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋，5 μm连续切片。SP法免疫组化染色步骤参照试剂盒说明书进行，SSH1抗体按1∶1 000比例稀释。DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、中性树胶封片，风干后光学显微镜下观察并拍照。

结果判定：由两名病理医师以盲法读片，结果不一致时由第三名高年资医师判定。SSH1阳性染色定位于细胞质。每张切片随机观察5个高倍视野，计数阳性细胞。阳性染色强度评分：0分，无着色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。阳性细胞比例评分：0分，0%～5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%。免疫组化评分为两项评分之和，0～3分判定为SSH1表达阴性，4～7分判定为SSH1表达阳性。

3. 术后随访：随访截止至术后5年，评价指标为总生存期(overall survival, OS)，即术后至随访终点内(因任何原因)死亡的时间。

四、统计学分析

结 果

一、SSH1在胃癌组织中的表达

Real-time PCR结果显示，胃癌组织中SSH1 mRNA相对表达量明显高于对照组非癌胃黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。免疫组化检测亦显示胃癌组织中SSH1蛋白呈阳性表达，而对照组SSH1基本为阴性表达(图2)。

图1胃癌患者(n=20)与对照组(n=20)胃黏膜组织SSH1mRNA表达比较

A：胃癌组织；B：对照组胃黏膜组织

图2胃癌患者与对照组胃黏膜组织SSH1蛋白表达比较(免疫组化SP法，×200)

二、SSH1表达与胃癌临床病理特征的关系

免疫组化检测显示，111例胃癌患者中71例癌组织中SSH1表达阳性，阳性率为64.0%，40例SSH1表达阴性。SSH1表达阳性胃癌患者淋巴结转移率明显高于SSH1表达阴性者(P<0.05)，SSH1表达与患者性别、年龄以及肿瘤部位、大小、病理类型、TNM分期无明显相关性(P>0.05)(表1)。

三、不同SSH1表达情况胃癌患者生存分析

Kaplan-Meier曲线生存分析显示，SSH1表达阳性 胃癌患者中位OS为25.60个月(95% CI: 19.75～31.45)，SSH1表达阴性患者中位OS为35.40 个月(95% CI: 26.77～44.03)，两组间差异有统计学意义(P=0.010, HR=1.71, 95% CI: 1.14～2.57)(图3)。

四、预后因素的单因素和多因素分析

应用Cox回归模型分析OS的影响因素，单因素分析显示病理类型、淋巴结转移和TNM分期为预后危险因素；将上述有统计学意义(P<0.05)的变量进一步纳入多因素分析，结果显示淋巴结转移和TNM分期为预后危险因素，两者HR分别为2.62(95% CI: 1.75～3.54)和2.78(95% CI: 1.23～3.41)(表2)。

表1 SSH1表达与胃癌临床病理特征关系分析

图3 不同SSH1表达情况胃癌患者生存分析

变量单因素分析HR95% CIP值多因素分析HR95% CIP值性别 1.120.96～1.330.378年龄1.030.76～1.130.219肿瘤部位1.040.91～1.350.084肿瘤大小1.820.81～3.120.055病理类型2.001.68～2.230.0001.250.98～1.420.053淋巴结转移1.231.05～1.310.0002.621.75～3.540.019TNM分期2.311.37～5.070.0002.781.23～3.410.030

讨 论

恶性肿瘤的进展和转移被认为是多种因素共同作用的结果，蛋白质的磷酸化与去磷酸化在细胞信号通路的调节中发挥重要作用，这一过程的失衡与肿瘤进展密切相关[10]。在哺乳动物中，由SSH1基因编码的SSH磷酸酶能通过对肌动蛋白解聚因子丝切蛋白去磷酸化而使之再激活，从而促进肌动蛋白丝解聚[4-6]，并由此参与肿瘤侵袭和转移。因此推测SSH1可能通过调节关键蛋白的磷酸化与去磷酸化过程影响胃癌进展和患者预后。

本研究以real-time PCR检测胃癌患者与对照组胃黏膜活检组织标本，结果显示胃癌组织SSH1 mRNA表达水平在整体上显著高于非癌胃黏膜。对两组标本的免疫组化检测亦显示胃癌组织中SSH1蛋白呈阳性表达。进一步检测111例胃癌患者术后癌组织标本中的SSH1蛋白表达，结果显示71例(64.0%)胃癌组织SSH1表达阳性。分析表明SSH1表达与淋巴结转移显著相关，与患者性别、年龄以及肿瘤部位、大小、病理类型、TNM分期均无明显相关性。生存分析显示SSH1表达阳性患者中位OS明显短于SSH1表达阴性患者(25.60个月对35.40个月)，提示SSH1表达与胃癌患者预后不良相关(HR=1.71)。上述发现表明SSH1与胃癌淋巴结转移和患者预后不良有关，然而其参与调节胃癌进展、转移的具体机制还需进一步研究。此外，Cox回归分析显示，淋巴结转移和TNM分期是胃癌患者预后不良的危险因素，提示SSH1对胃癌预后的影响可能与参与肿瘤淋巴结转移有关。

本研究的局限性主要在于，患者出院后仍继续接受治疗，出院后治疗手段难以均一化导致结局事件的影响因素难以完全掌控。此外，本研究随访分析指标仅OS一项，而未评估无进展生存期、疾病进展时间等指标。后续研究设计需弥补上述缺陷。

综上所述，本研究通过分析胃癌患者癌组织中的SSH1表达情况，并对患者进行长期随访观察其5年生存率，发现SSH1在胃癌患者癌组织中表达增高，并与预后不良有关，有望成为预测胃癌患者预后的生物学标记物。