微小RNA-182-5p调控焦亡参与肝缺血再灌注损伤

2018-10-19杜晨阳宋虎王星星王振张建军

天津医药 2018年10期

杜晨阳，宋虎，王星星，王振，张建军△

肝缺血再灌注损伤（liver ischemia reperfusion injury，LIRI）是肝脏手术和肝移植中常见的病理过程，对患者的预后和生存具有相当大的影响［1］。焦亡（Pyroptosis）是一种促炎性程序性细胞死亡，具有坏死和凋亡的生化和形态学特征，但与凋亡或坏死不同是其主要依赖于半胱天冬酶1（Caspase1）产生炎症级联反应，引起细胞因子释放，激活促炎性免疫细胞介质，最终产生组织细胞损伤［2］。焦亡使组织细胞对缺血再灌注更加敏感，再灌注后损伤加重，在缺血再灌注损伤病理过程中发挥重要作用［3］。微小RNA（miRNA）是长度约为19～22个核苷酸的内源性微小非编码RNA，能够参与多种生物学过程，包括细胞增殖、分化、转移、凋亡和免疫应答［4-5］。miRNA的异常表达可发生于多种疾病，参与多种疾病（包括缺血再灌注损伤）的发病机制［6］。本研究旨在探索miR-182-5p介导叉形头转录因子O亚型3a（FoxO3a）调控的焦亡对肝细胞缺血再灌注损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料及分组

1.1.1 主要试剂及材料 40只健康雄性SPF级C57小鼠，鼠龄7～8周，体质量20～24 g，购于天津医科大学实验动物中心。小鼠肝细胞系AML12购于中科院上海细胞库。胎牛血清购于美国Gbico公司。CCK-8试剂盒购于日本同仁公司。qRT-PCR试剂盒购于日本TAKARA公司。ELISA检测试剂盒购于德国ORGETEC公司。兔抗鼠FoxO3a、Caspase1、白细胞介素（IL）-1β、IL-18和GAPDH抗体，以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗和FITC荧光标记兔抗小鼠IgG购于美国CST公司。miR-182-5p模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）购于锐博公司。FoxO3a基因的干扰RNA（siRNA）购于美国Sigma公司。

1.1.2 动物模型建立及分组按随机数字表法将40只小鼠分为5组，每组8只，分别为假手术（sham）组，缺血再灌注（IR）各组（缺血1.5 h，按再灌注时间分为IR 2 h组、IR 6 h组、IR 12 h组和IR 24 h组）。小鼠禁食6～8 h后，使用5%水合氯醛（0.15 mL/20 g）进行腹腔注射麻醉，固定小鼠，经腹正中纵行切口开腹（切口长3～5 cm），暴露腹腔脏器，动脉夹夹闭肝左、中叶脉管（包括门静脉、肝动脉与胆道）的共干，模拟70%的肝脏缺血，1.5 h后松开血管夹，随后进行关腹。Sham组小鼠仅行开腹、游离第一肝门及关腹，不行夹闭血管操作。各组达到预定再灌注时间后获取肝组织标本。

1.1.3 细胞缺氧/复氧模型（缺血再灌注处理）的建立及分组将AML12细胞接种至6孔板，培养至细胞融合度为70%左右。细胞实验分组分为两部分，（1）缺氧模型建立，分为control组（37℃、5%CO2培养箱中常规培养）和IR组（缺氧1.5 h，复氧6 h）。（2）缺氧/复氧模型建立，分为control组（转染miR-182-5p空载体）、mimic组（转染miR-182-5p模拟物），inhibitor组（转染miR-182-5p抑制物）和inhibitor+siRNA（细胞转染miR-182-5p抑制物的同时转染FoxO3a siRNA以降低FoxO3a表达）。各组转染后置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。12 h后更换新鲜培养基，继续培养48 h后移去培养基，加入2 mL Hank’s培养液，放入模拟缺氧专用培养箱（O2浓度＜5%），模拟缺血/缺氧状态。1.5 h后移去Hank’s液，加入2 mL完全培养基，于37℃、5%CO2培养箱中继续培养6 h，模拟再灌注/复氧。

1.2 实验方法

1.2.1 分析miR-182-5p与FoxO3a基因相关性

1.2.2 qRT-PCR检测小鼠肝组织标本和AML12细胞转染后miR-182-5p、FoxO3a和Caspase1的表达 Trizol法提取肝组织或细胞总RNA，根据操作说明反转录为cDNA，miR-182-5p引物上游5'-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3'，下游5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；FoxO3a引物上游5'-CTGGGGGAACCTGTCCTATG-3'，下游5'-TCATTCTGAAC⁃GCGCATGAAG-3'；Caspase1引物上游 5'-ACACGTCTT⁃GCCCTCATTATCT-3'，下游 5'-ATAACCTTGGGCTT⁃GTCTTTCA-3'；GAPDH引物上游5'-CCACCCAGAAGACT⁃GTGGAT-3'，下游5'-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3'。经过94℃预变性30 s；94℃变性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，扩增45个循环。对结果使用比较阈值法进行定量分析，其计算方法是：目的基因相对定量值=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，计算各组目的基因相对定量值。

1.2.3 HE染色取各组肝脏组织左、中叶，放入4%多聚甲醛内固定、梯度乙醇、二甲苯脱水后包埋蜡块，切片后按照操作流程行HE染色，显微镜下观察各组小鼠肝组织的病理学变化。

1.2.4 免疫细胞化学染色每组经转染和缺血再灌注（IR）处理后的细胞用胰酶消化重悬，接种于24孔板中。37℃、5%CO2培养箱培养48 h后，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶染色（SP法）检测Caspase1表达分布。室温下4%多聚甲醛处理20 min，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶15 min，5%山羊血清封闭1 h，孵育Caspase1一抗（稀释度1∶500）于4℃过夜。室温下孵育二抗1 h。二氨基联苯胺溶液（DAB）显色、苏木精染核后光镜显微镜下观察并采集图像。

1.2.5 细胞免疫荧光染色将每组经转染和IR处理后的细胞用胰酶消化重悬，铺板制作细胞爬片，4%多聚甲醛固定爬片15 min，0.5%Triton X-100室温通透20 min，5%山羊血清封闭1 h，4℃环境下孵育Caspase1一抗（稀释度1∶500）过夜。室温下孵育荧光二抗（湿盒内）1 h。滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核。使用荧光封片剂封片后在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.6 CCK-8法检测细胞活性各组处理后的细胞重悬后接种到96孔板中（100 μL/孔），37℃、5%CO2培养箱中预培养，加入CCK-8溶液（10 μL/孔），培养箱内继续培养48 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.2.7 ELISA检测IL-1β、IL-18浓度各组细胞消化后超速离心，吸取上清后按照ELISA试剂盒说明书加入试剂进行IL-1β和IL-18浓度的检测。

1.2.8 蛋白免疫印迹实验（Western blot）检测各目的蛋白表达情况各组细胞或肝组织加入裂解液，于4℃超速离心机离心（12 000 r/min，15 min）后吸取上清，BCA法蛋白定量。每组取50 μg/孔行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，孵育一抗（兔抗鼠FoxO3a、Caspase1、IL-1β、IL-18与GAPDH，1∶1 000），4 ℃环境下孵育过夜，TBST洗3遍后室温下孵育羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗（1∶5 000）1 h，等比例加入混合发光液后与PVDF膜反应，曝光并保存图片，使用Image J软件测定条带灰度值。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，其中2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血再灌注损伤（IRI）诱导小鼠肝脏产生焦亡和炎症 HE染色显示：sham组肝小叶结构基本清晰，肝细胞排列较规整，未见明显的肝细胞坏死和中性粒细胞浸润；与sham组比较，再灌注2 h组肝小叶结构欠清晰，肝细胞排列较整齐，汇管区可见少量的胆管增生及中性粒细胞浸润；再灌注6 h组部分肝小叶结构紊乱，可见小片的肝细胞坏死、中性粒细胞、胆管上皮增生。再灌注12 h组肝小叶结构明显紊乱，可见中央静脉周围大片的肝细胞坏死灶及大量的中性粒细胞浸润；再灌注24 h组肝小叶结构欠清晰，肝细胞排列较为规整，肝窦内可见少量的中性粒细胞浸润；再灌注12 h组小鼠肝组织破坏最严重，见图1A。Western blot结果显示，随再灌注时间延长，FoxO3a、Caspase1和IL-1β表达量较sham组逐渐升高，且在12 h时达峰值，再灌注24 h相对12 h表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1B、表1。qRT-PCR从mRNA水平定量检测小鼠肝组织中miR-182-5p表达水平：12 h组miR-182-5p表达量（14.43±0.40）较sham组（6.12±0.41）明显升高（t=14.322，P＜0.05），差异有统计学意义。

2.2 IR处理可诱导AML12细胞焦亡体外培养AML12细胞，分为2组，Control组常规培养，IR组进行细胞缺氧1 h/复氧12 h处理。qRT-PCR检测结果显示：IR组miR-182-5p表达量较Control组升高（P＜0.05）；而IR组FoxO3a表达量较Control组降低（P＜0.05），见图2，表2。免疫荧光检测Caspase1表达情况：IR组Caspase1表达量较Control组升高（P＜0.05），见表2。

2.3 miR-182-5p直接调控FoxO3a 基因相关性分析显示，miR-182-5p与FoxO3a基因具有高度相关性，见图3A。qRT-PCR测定转染后细胞内miR-182-5p表达情况：mimic组miR-182-5p mRNA的相对表达量较Control组升高，inhibitor组较mimic组和Control组降低（P＜0.05），见表3。免疫细胞化学染色结果显示：mimic组FoxO3a阳性细胞率较Control组降低，inhibitor组FoxO3a阳性细胞率较Control组和mimic组均升高（P＜0.05），见图3B，表3。

2.4 FoxO3a通过调节细胞焦亡参与LIRI Western blot结果显示，与Control组相比，inhibitor组的FoxO3a表达升高，Caspase1表达降低（P＜0.05）；而inhibitor+siRNA组与inhibitor组相比，FoxO3a表达降低，Caspase1表达升高（P＜0.05），见图 4、表 4。ELISA检测结果显示，inhibitor组的IL-1β和IL-18浓度较Control组降低；而inhibitor+siRNA组IL-1β和IL-18浓度较inhibitor组升高（P＜0.05），见表4。CCK-8检测显示：inhibitor组细胞活性较Control组升高，而inhibitor+SiRNA组较inhibitor组降低（P＜0.05），见表4。

Tab.1 The relative expressions of related proteins of liver tissues in five groups of m ice表1 小鼠肝组织中各目的蛋白表达量（n=5，±s）

＊P ＜0.05，＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与2 h组比较，c与6 h组比较，d与12 h组比较，P＜0.05

组别sham组IR 2 h组IR 6 h组IR 12 h组IR 24 h组F FoxO3a 0.715±0.041 0.735±0.029a 0.764±0.022ab 0.816±0.031abc 0.739±0.023abcd 62.361＊＊Caspase1 0.314±0.012 0.548±0.018a 0.532±0.021ab 0.770±0.027abc 0.461±0.014abcd 112.574＊＊IL-1β 0.361±0.014 0.471±0.026a 0.471±0.013ab 0.618±0.016abc 0.557±0.015abcd 12.663＊＊IL-18 0.490±0.023 0.601±0.018a 0.606±0.022ab 0.778±0.019abc 0.829±0.011abcd 13.460＊＊

Tab.2 The expression levels of m iR-182-5p and FoxO3a m RNA of liver tissues by qRT-PCR and the expression of Caspase1 of liver tissues by immunofluorescent staining表2 qRT-PCR检测m iR-182-5p与FoxO3a的mRNA表达情况及免疫荧光检测Caspase1表达情况（n=5，±s）

＊P＜0.05

组别Control组IR组t qRT-PCR miR-182-5p 1.000±0.000 2.361±0.639 4.258＊FoxO3a 1.000±0.000 0.214±0.079 7.601＊免疫荧光Caspase1 0.110±0.007 0.279±0.017 9.062＊

Tab.3 The expression levels of cellular m iR-182-5p m RNA detected by qRT-PCR and the expression of FoxO3a detected by immunohistochem istry staining表3 qRT-PCR检测细胞内m iR-182-5p m RNA表达情况和免疫组化检测FoxO3a表达情况（n=5，±s）

＊P＜0.05；a与Control组比较，b与mimic组比较，P＜0.05

组别Control组mimic组inhibitor组F miR-182-5p 1.00±0.00 4.41±0.25a 0.87±0.04ab 3.09＊FoxO3a阳性（%）67.1±2.9 32.7±2.6a 87.4±1.4ab 3.86＊

3 讨论

Fig.4 The FoxO3a and Caspase1 expressions detected by Western blot assay图4 Western blot检测FoxO3a和Caspase1表达量

LIRI是肝脏手术、肝移植中重要的病理生理过程。肝脏移植是治疗终末期肝病最有效的办法，为了改善供体器官严重短缺的问题，边缘供体（对IRI高度敏感）越来越多地应用于临床［7-8］。因此，如何研究出针对IRI的保护性策略以更好地保护移植物功能是亟待解决的临床问题。有研究表明，凋亡、坏死是IRI后肝细胞死亡的主要方式［9］，笔者在之前的研究中也发现自噬能有效减轻LIRI的损伤效应，发挥保护作用［10-11］。而细胞焦亡是一种独特的程序性细胞死亡，其不同于细胞凋亡、坏死及自噬，能在LIRI中发挥至关重要的作用［12］。本研究表明，焦亡的特征在于IR后caspase-1、IL-1β和IL-18表达增加，同时也伴随着肝组织损伤加重；而体外细胞培养研究表明，IR处理后AML12小鼠肝细胞中caspase-1表达上调。综合这些结果表明，焦亡和炎症反应与LIRI关系密切。

焦亡的特征是快速的胞质膜破裂和促炎因子的释放，并且在形态学和机制上不同于凋亡、坏死等其他形式的细胞死亡［13］。Caspase1依赖性是焦亡的一个显著特征，焦亡的产生归因于Caspase1诱导细胞膜上的孔形成，进而导致大量的炎性因子的产生和释放［14］。Chen等［15］发现脓毒性急性肝损伤过程中，肝细胞焦亡能加重急性肝损伤，通过NLRP3和Caspase-1抑制剂抑制肝细胞焦亡，降低脓毒性肝损伤的程度。Heo等［16］报道了酒精性肝炎（AH）患者和实验动物模型中miR-148a表达显著降低，发现酒精通过FoxO1降低肝细胞中的miR-148a表达，促进TXNIP过表达和NLRP3炎性体激活，进一步诱导肝细胞焦亡。

miRNA已经成为翻译控制的重要媒介，广泛参与多种生物学过程。miRNA的过表达是各种疾病中的常见现象，并且异常表达的miRNA经常参与特定疾病（包括LIRI）的发病机制［17］。Li等［18］报道了过表达miR-17可以通过抑制Stat3表达来上调自噬以加重肝 IRI。Pellegrini等［19］通过研究发现 miR-155通过调节炎症细胞募集和呼吸氧化爆发来加重缺血再灌注损伤，IRI后miR-155的表达显著增加，这与IRI后人类肌肉组织中肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1β、CD105和Caspase-3的表达增加以及白细胞浸润相关。而Jiang等［20］研究发现miR-146a能够直接抑制IRAK1和TRAF6以减轻缺血再灌注后肝细胞凋亡和多种炎症介质的释放，最终达到减轻肝缺血再灌注损伤的作用。Li等［21］发现miR-30b通过与Atg12特异性结合而与Atg12-Atg5偶联物发生相互作用，miR-30b的过表达能降低Atg12和Atg12-Atg5偶联物水平，促进IR后自噬的产生，减轻LIRI。本研究显示IRI小鼠肝组织和IR处理后的体外培养小鼠肝细胞中miR-182-5p的表达显著增加。通过TargetScan数据库预测显示FoxO3a是miR-182-5p的潜在靶基因。Chen等［22］报道了FoxO3a参与抑制细胞凋亡、促进IR后肝细胞再生。本研究发现敲除FoxO3a后Caspase1、IL-18、IL-1β表达升高，说明FoxO3a能抑制肝细胞焦亡；miR-182-5p过表达导致FoxO3a表达降低，而miR-182-5p的低表达处理后能导致FoxO3a表达升高，进一步减弱AML12细胞的炎性细胞死亡，表明FoxO3a可能是miR-182-5p调控焦亡的靶点，抑制miR-182-5p表达进而促进FoxO3a表达，可能作为预防肝细胞焦亡，减轻肝细胞损伤的有效策略。

Tab.4 Comparison of expressions of related proteins in AML12 cells,concentrations of IL-1β and IL-18 and cell viability detected by ELISA between three groups表4 AM L12细胞中目的蛋白相对表达量、ELISA检测IL-1β和IL-18浓度及细胞活性检测结果比较（n=5，±s）

＊P＜0.05；a与Control组比较，b与inhibitor组比较，P＜0.05

组别Control组inhibitor组inhibitor+siRNA组F Western blot FoxO3a 0.680±0.012 0.979±0.018a 0.271±0.011b 3.851＊Caspase1 0.702±0.037 0.557±0.022a 0.769±0.026b 4.137＊IL-1β（ng/L）17.90±0.48 9.54±0.49a 18.01±0.48b 8.524＊ELISA IL-18（ng/L）14.84±0.68 7.16±0.58a 15.16±0.71b 6.883＊细胞活性（%）46.22±2.49 83.57±2.94a 45.22±2.59b 8.372＊

总的来说，本研究表明由IRI引起的肝细胞焦亡可由miR-182-5p通过直接靶向调控Foxo3a以促进其产生。然而，除了FoxO3a/Caspase1途径之外，miR-182-5p对肝缺血再灌注损伤的影响可能由多种机制介导，并且需要进一步研究以揭示其他相关的重要机制。本研究发现了miR-182-5p在LIRI中的重要作用，有助于理解焦亡在缺血再灌注肝损伤中的作用，同时也为临床工作中减轻肝脏手术和肝移植后LIRI提供了新思路。

（图1～3见插页）