肠复康方对大肠癌细胞多药耐药的逆转作用机制研究

贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002

大肠癌是人们日常生活中最常见的恶性肿瘤之一[1]，伴随着社会经济的进步以及生活水平的改进，大肠癌的发病率在常见病中日益增长。化疗给人们带来的治疗效果不是很明显，在很大程度上是因为肿瘤细胞已经对化疗药物产生了耐药性，并且这也一度被认为是对肿瘤进行化疗等治疗失败的关键原因。肠复康是目前在临床上针对大肠癌这一疾病治疗的经典方药，并且普遍应用在大肠癌放化疗的过程中及大肠癌术后的中医理疗康复阶段甚至癌症晚期辅助保守治疗。通过一定数量的临床数据的分析及研究表明，肠复康经方在大肠癌不同阶段的治疗过程中具有积极的治疗作用。杨彦等[2]对肠复康胶囊治疗大肠癌临床疗效研究发现，肠复康胶囊治疗大肠癌有一定的治疗效果，能够有效的控制肿瘤的复发。肠复康抗肿瘤作用是否与逆转肿瘤多药耐药有关，本课题研究了肠复康抗肿瘤作用是否与多药耐药有关系，目的为开发治疗抗肿瘤的新的有效药物提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 实验动物 20只SD大鼠，雌雄各半，体重(260±20)g，由贵州医科大学实验动物中心提供(合格证号SCXK黔2002-0001)。

1.2 实验细胞 株人大肠癌细胞株HCT-8与耐长春新碱细胞株HCT-8/V，购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.3 材料 乙醇(CAS号：64-17-5，东莞市乔科化学试剂制造有限公司)；人参、鸦胆、薏苡仁、莪术、喜树果均购置贵阳南明区各大药房；胎牛血清(CAS号：10270-106，杭州四季青生物材料研究所)；RIPA组织裂解液(批号：R0010，Fermentas)；BCA蛋白定量(批号：PC0020，上海博彩生物科技)；Anti-Bax(批号：ab32503，cell signaling)；Anti-Bcl-2(批号：ab182858，cell signaling)；Anti-mmp-2(批号：ab58803，cell signaling)；GAPDH(批号：E021010，cell signaling)

1.4 仪器 FA1004A电子分析天平(广州衡祥电子有限公司)；TDL-40B台式离心机(Anke)；PowerPac系列Western Blot的全套设备(美国Bio-Rad公司)；TS-1型脱色摇床(金坛市华城润华实验仪器厂)；Alpha Innotech凝胶成像分析系统(美国Alpha公司)；InfiniteM200酶标仪(Tecan Systems Inc.)

2 方法

2.1 含药血清制备 将20只SD大鼠随机分成两组，正常动物组和肠复康给药组，雌雄各半，正常组动物灌胃双蒸水，给药组灌胃肠复康16.5 mg/kg，每天1次，连续给药7 d，最后一天给药1 h后，在动物清醒状态下进行股动脉采血，血清室温放置1 h，4000 r/min离心15 min，分离血清，将同组动物血清归总，55 ℃水浴30 min，灭活补体，-20 ℃保存[3]。

2.2 HCT-8/V细胞培养 ①取对数生长期的细胞制备成1×105细胞悬液，接种于25 cm2培养皿置 37 ℃，5%CO2的孵育24 h。②加药，分别设置HCT-8/V加20%胎牛血清，HCT-8/V加20%大鼠空白血清，HCT-8/V加20%含药血清组，每组各3瓶，放置37 ℃，5%CO2的孵箱中继续孵育72 h。

2.3 提取蛋白质和定量 用RIPA裂解液+1%蛋白酶抑制剂在匀浆器中裂解细胞，在酶标仪上测量蛋白浓度，-80 ℃分装保存备用。

2.4 Western Blot法检测多药耐药蛋白P-gp、LRP、MRP1、COX-2表达的影响 通过制胶，跑电泳，转膜，封闭2 h，孵一抗4度过夜，洗膜3次，孵二抗1 h后显影曝光等步骤得出相应的蛋白表达。

3 结果

3.1 肠复康对HCT-8/V细胞耐药基因蛋白表达的影响 Western Blotting实验结果显示，肠复康含药学期作用于HCT-8/V细胞后，P-gp蛋白的组1与组2相比，差异无统计学意义(P﹥0.05)，3组与1组相比，P-gp蛋白表达(0.32±0.04)%明显降低，差异有显著统计学意义(P﹤0.01)(见表2，图1)；LRP蛋白的组1与组2相比，表达差异无统计学意义(P﹥0.05)，LRP蛋白表达(0.077±0.01)%明显降低，差异有显著统计学意义(P﹤0.01)(见表2，图1)；MRP1蛋白组1与组2相比，表达差异无统计学意义(P﹥0.05)，3组与1组相比，MRP1蛋白表达(0.36±0.05)%明显降低，差异有显著统计学意义(P﹤0.01)(见表2，图1)；COX-2蛋白组1与组2相比，表达差异无统计学意义(P﹥0.05)，3组与1组相比，COX-2蛋白表达(0.31±0.01)%明显降低，差异有显著统计学意义(P﹤0.01)(见表2，图1)。结果显示肠服康可以显著降低P-gp、LRP、MRP1、COX-2。

表2 肠复康对HCT-8/VCR细胞耐药基因表达的影响

注：1.表示HCT-8/VCR +20%胎牛血清，2.HCT-8/VCR+20%大鼠空白血清，3. HCT-8/VCR +20%含药血清。1组与2组比较，*P﹥0.05；1组与3组比较，#P﹤0.01。

3 讨论

大肠癌是人们日常生活中最常见的恶性肿瘤之一[4]，而且发病率在常见病中日益增长，临床上普遍采用的的治疗方法仍旧是放疗与化疗两种，但是在杀死癌细胞的同时，也能够杀死正常细胞。近年来，中医药在保持原有中医特色治疗大肠癌的同时，利用现代科学技术对中医抗大肠癌的作用机制作出了很多的探究，特别是在对肿瘤多药耐药的治疗取得了一定程度的进展。

P-gp在大肠癌中表达水平最高，在一些病理状况下，P-gp会出现异常的高表达状态。多种恶性肿瘤组织中均有P-gp水平的上调[5-6]，而恶性肿瘤细胞中过量的P-gp糖蛋白表达，促使一些具有亲脂特性的化疗药物通过ATP能量泵使其从肿瘤细胞中被泵出，介导肿瘤的多药耐药[7]；肺蛋白酶(LRP)存在于各种人的正常细胞组织和恶性肿瘤细胞中，在恶性肿瘤细胞中抗癌药物被清除或者毒性下降[8]；多药耐药相关蛋白l(MRPl)在人类组织器官中普遍存在，并且MRPl被称作为“药物外排泵”，因为MRPl具有改变药物在细胞内部的形态分布，从而能够导致相关耐药性的产生，赋予细胞耐药的表型。MRP1可能是提示预后的分子标志物，并有助于选择合理化疗药物[9-10]；环氧化酶(Cyclooxygenases，COXs)是一种限速酶。目前只发现于某些细胞，COX-2的高表达可在大肠癌局部形成免疫抑制[11]。经过大肠癌组织中COX-2蛋白的表达检测，表明其对治疗大肠癌以及对其预后的评判有积极作用。

综上，肠复康的作用机理可能与相关蛋白P-gp、LRP、MRP1及COX-2的表达有相关性，并且在相当程度上具有逆转多药耐药的作用。另外，因为口服中药对比起来副作用较小，并且价格相对低廉而作用积极，普遍被患者所接受，而随着中药在肿瘤多靶点治疗以及在多药耐药机制方面的不断探索，中药治疗大肠癌必定会成为一种新的主要治疗方法，为抗肿瘤的有效治疗开创新的前景。