基于Y形光纤的便携式免疫荧光定量检测系统*

苏广，胡志刚,2△，杜喆，祖向阳

(1.河南科技大学医学技术与工程学院，河南 洛阳 471003； 2.河南省机器人与智能系统重点实验室，河南 洛阳 471003)

1 引 言

当今大型自动化分析仪与流水线的模块组合和小型仪器简单操作的POCT(point-of-care testing,POCT)是检验医学的两大发展方向，随着临床检测“去中心化”的发展趋势，POCT以其仪器和试剂体积小、便携、操作简单且能快速获得结果等特点，正广泛应用于医院及院外患者管理。

荧光免疫层析技术是荧光标记技术与免疫层析技术创新性结合发展起来的一种新型POCT定量检测技术，与以胶体金免疫层析为代表的传统POCT定性检测技术相比，不仅保留了操作简便、检测快速、便携性强的优点，同时通过荧光示踪增强技术实现了检测结果的精确定量。该技术灵敏度高、特异性强，是目前POCT检测技术的主要研究方向[1]，与该技术配套的荧光定量检测仪器也越发受到重视[2]。在荧光定量检测仪的设计中，激光诱导荧光检测的光学设计方案是其中的核心部件，目前常见的设计方案有共聚焦式光学结构检测法[3]、光纤式光学结构检测法[4]、图像处理检测法[5]等，其中共聚焦式光学结构组装复杂，体积大，不利于仪器的小型化；基于图像处理法的免疫荧光检测系统成本高昂，且功耗较高。因此，本研究采用光纤式光学结构，以激光二极管作为激发光源，Y形光纤进行激光传导及荧光收集，硅光电二极管作为荧光检测传感器，光路结构简单，设备体积小；设计Sallen-Key拓扑结构三级二阶具有巴特沃斯响应的有源低通滤波器对微弱信号进行滤波放大处理；另外，本研究采用STM32F103ZET6微处理器、ADS1255模数转换器、TB62209步进电机驱动芯片设计了核心电路，实现对免疫荧光信号的扫描检测。

2 Y形光纤结构及检测原理

Y形光纤成分为掺高羟基离子石英，在250～1 200 nm波长范围内，光波传播基本不受影响，无能量衰减。Y形光纤的结构及检测原理示意图见图1，两端分别为分叉端和探头端。分叉端一端与激光二极管相连作为光源，由直径600 μm的单一光纤构成，另一端与光电二极管连接，构成荧光-电信号转换装置，由12根200 μm的细光纤组成；二者相交后以600 μm的大光纤为中心，12根200 μm的小光纤围绕大光纤按卫星式排布形成探头端，探头直径为6.35 mm。

相对于镜片式光学结构组装的复杂性，Y形光纤式结构只需简单的控制探头到待检测样品的距离。距离的大小与光纤的数值孔径有关，多模光纤的数值孔径是一个无量纲的数，能够描述光纤端面接收光的能力，即接收光的角度范围。数值孔径大小NA由式(1)决定：

图1 Y形光纤结构图

(1)

其中n为样品与光纤端面之间介质的折射率，θ为接收角的一半，只有入射角度小于θ的光线才能发生全反射被传输，数值孔径的大小取值一般要兼顾光接收能力和对模式色散的影响。本系统不需要考虑到光线传输的时延差，为了获得更高的耦合效率，选择数值孔径为0.37的多模光纤，光线束的数值孔径与所构成的单根光纤的数值孔径相同，因此，光纤束探头端的数值孔径为0.37，接收角度范围为22°，通过实际样本区的大小即可计算出探头到样本的距离。

3 系统硬件设计

3.1 整体方案设计

系统总体框图见图2，由微处理器核心模块、光路结构模块、荧光信号采集及滤波放大模块、模数转换模块、步进电机驱动模块、激光驱动模块、热敏打印机模块等构成。STM32F103ZET6微处理器通过脉冲信号方式控制步进电机驱动模块，步进电机带动试纸条传动机构将试纸条递送到光纤探头所处位置；试纸条上被激发的微弱荧光信号经过Y形光纤收集后照射到光电二极管的光接收窗口，使得光电二极管产生微弱的电流信号，电流信号经过电流/电压转换以及放大滤波处理，由模数转换电路处理成数字信号送至STM32F103ZET6微处理器进行处理。微处理器再通过热敏打印机或者电容式触摸屏输出荧光信号采集结果。

3.2 单元电路设计

3.2.1激光二极管驱动电路 Y形光纤的光源端与激光二极管相连将激发光传输到探头端对样本进行荧光激发，为了避免激发光光强的波动给荧光信号的采集带来干扰，需要输出稳定的电流来驱动激光二极管。在本设计中，采用稳压源加三极管的方式构建恒流源电路，通过控制发射极电流恒定使集电极输出稳定的激光二极管驱动电流(见图3)。在实际应用中，选用波长488 nm，最大输出功率60 mw的激光二极管，其工作电流为50 mA，通过调节稳压源电压和三极管发射极电阻的比值来控制输出电流的大小。

图2 系统总体框图

图3 恒流源驱动电路原理图

Fig3Digramaofexcitationsourcedrivedbyconstant-currentsource

3.2.2荧光信号采集及滤波放大电路 Y形光纤的检测端通过滤光片和聚焦透镜将荧光传输到光电二极管的光接收窗口。光电二极管在光伏模式下能够将荧光信号转换成微弱的电流信号，然而采集到的微弱电流信号通常会混杂噪声，在对硅光电二极管光电检测电路噪声特性的研究基础上[6]，本研究设计了光电二极管的前级I/V转换电路和滤波放大电路。图4为I/V转换电路，通过调节反馈电阻的大小控制输出电压，在运放同相端加入匹配电阻和匹配电容，减小输入偏置电流、输入失调电压和温漂的影响。其输出电压和输出信号带宽分别为：

VP=IP×R2

(2)

(3)

为了提高整个系统的信噪比，需要对采集到的电流信号进行滤波放大处理，本部分电路采用Sallen-Key拓扑结构设计三级二阶有源低通滤波电路，并提供巴特沃斯响应，在通带范围内无纹波，截止频率处具有良好的衰减效果[7]。

图4 前级I/V转换电路原理图

Fig4Schematicdiagramofconversioncircuit

图5为滤波放大电路原理图，其各级电路参数的计算类似第一级参数的计算方法，如下：

C4=mC3

(4)

(5)

(6)

(7)

其中，m为电容扩展系数，Q为品质因数(第一级0.5176、第二级0.7071、第三级1.9319)，K为放大倍数，ωc为截止频率。

图5 三级二阶有源低通滤波放大电路原理图

Fig5Schematicdiagramoflowpassfilteramplifier

3.2.3模数转换电路 在微弱荧光信号采集系统中，可能需要对多路不同波长的荧光信号进行采样，为了方便系统扩展而又不造成资源浪费，本系统选用ADS1255集成24位Δ-Σ型ADC构成单极性双通道模数转换电路(见图6)，大大简化了信号调理电路，减小了电路板面积、减少了器件数量和生产成本。此电路使用外部精准基准电压源ADR4525产生AD芯片的基准电压，具有高精度、低漂移、低噪声、低静态电流等特性。这些特性使得ADR4525非常适合便携式设备的高精度转换应用，它与ADS1255相结合，能够实现具有相当好的集成度和精度的低功耗微弱荧光信号模数转换电路。

图6 模数转换电路原理图

3.2.4步进电机驱动电路 试纸条传动机构运行的稳定性和定位的精确性对检测结果有着至关重要的影响。该系统采用东芝公司的步进电机驱动芯片TB62209设计步进电机驱动电路，具有最高16细分、峰值电流1.8 A、自动半流锁定和步进脉冲驱动等特性。另外还有两路槽型光耦限位电路，作为试纸条传动机构的零位信号和限位信号，槽型光耦设计为常闭状态，当运动超过限定位置或故障时发送报警信号。电路原理图见图7。

图7 步进电机驱动电路原理图

4 软件设计

软件底层驱动部分主要有LCD驱动模块、微型打印机驱动模块、串口驱动模块、AD采样驱动模块、步进电机驱动模块、激光二极管驱动模块。实时操作系统采用μCOS-III内核，它是一个实时多任务内核，具有易移植、可扩展、可固化、快速响应中断等优点，适合应用到荧光检测平台。软件代码的编写使用C语言、调试仿真都基于Keil集成开发环境，结合ST公司的固件库、StemWin图形用户接口库、μCOS内核、FatFs文件系统实现系统硬件设备的控制和荧光信号的扫描检测。系统的总流程图见图8。

图8 系统软件流程图

5 系统测试结果与分析

5.1 AD精度测试

为了测试AD采样精度，使用3个不同的参考点电压作为AD的模拟输入信号，对系统的模数转换性能进行评估。分别对3个参考电压点连续采集200个数据，测试结果见表1。在较稳定的地参考点和基准电压参考点具有很小的采样偏差和标准差，该系统的模数转换模块具备很好的精度和重复性。

表1 AD采样实验

5.2 荧光微球实测实验

为了测试本系统的灵敏度，采用苏州为度生物技术有限公司生产的300 nm绿色荧光微球，其激发波长和发射波长分别为488 nm和520 nm，分别对其稀释8、16、32、64、128、256倍，对不同浓度梯度的微球荧光进行扫描检测，得到的各个梯度浓度的荧光信号转换电压值曲线见图9。

图9 微球荧光稀释浓度与电压值曲线图

Fig9Thecurveoffluorescencedilutingfactorandmagnitudeofvoltage

将上述扫描检测数据取波峰值与稀释倍数拟合曲线(见图10)，其乘幂趋势良好，相关系数为0.9971，说明该荧光检测系统灵敏度高，即使在稀释倍数足够大的情况下，仍然能够获取有效信号值。

图10 光电转换信号与稀释倍数的线性关系

Fig10Thecorrelationbetweenphotoelectricconversionsignalanddilutingfactor

6 结束语

Y形光纤式免疫荧光定量检测系统经过平台搭建调试，实测表明能够很好完成免疫荧光信号的定量检测。该系统使用Y形光纤作为光信号的传输介质，光电二极管将荧光信号转换成电压信号，在经过有源滤波和放大之后，通过模数转换模块能够稳定精确地转换成数字信号，试纸条传动机构具有高效稳定、低噪声、精准定位的工作表现，整个装置占用空间小，功耗低，安装结构简单，仪器成本低，检测结果灵敏度高，重复性好。