内皮细胞特异性分子-1对内毒素致小鼠急性肺损伤时炎症反应的影响

张晓隆，吴海亚，陈洁，吴成云

（温州医科大学附属第二医院，浙江 温州 325027，1.重症医学科；2.呼吸内科）

内毒素性急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS）是临床常见急危重症，病死率高[1]。其主要病理特征是肺组织大量中性粒细胞浸润和肺泡-毛细血管屏障损伤所致的肺水肿。目前认为促炎介质的过度释放导致的炎症失控是内毒素性肺损伤的主要发病机制。在此理论基础上发展而来的防治策略，主要通过抑制关键炎症介质的表达和效应，防止过度炎症反应[2-3]。虽然有大量研究[4-5]

显示，从不同角度对ALI的防治取得了一定成效，但其效果仍然不够理想。因此，寻找新的有效治疗手段，改善内毒素性ALI是目前亟待解决的问题。目前，国内外在内皮细胞特异性分子-1（Endocan）的研究主要局限于其参与恶性肿瘤的发生、发展和血管生成等，对炎症反应时黏附分子介导的细胞迁移及特异性免疫应答的报道甚少[6]。本研究采用雾化吸入脂多糖（lipopolysac charides，LPS）建立小鼠内毒素性ALI模型，使用外源性Endocan来干预小鼠内毒素性ALI的变化，观察其对内毒素性肺损伤的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物与主要试剂 SPF级C57BL/6雄性小鼠30只，平均体质量（20±2）g，由温州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（浙）2015-0001。LPS购自美国Sigma公司，Endocan重组蛋白购自美国CLOUD-CLONE CORP公司，髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）购自美国R&D公司；肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒购自法国Diaclone公司。

1.2 模型复制与分组 将30只小鼠按随机数字表法分为Control组、LPS组和Endocan组，每组10只。LPS雾化吸入法建立小鼠ALI模型，自动雾化吸入装置启动后，空气压缩机将压缩后的空气送到装有LPS浓度为400 μg/mL的塑料管中，使LPS成为雾状液体，接入装有小鼠的密闭容器中，持续雾化30 min，Control组雾化吸入相同时间和等量的0.9%氯化钠溶液。Endocan组于实验前30 min腹腔注射Endocan 0.25 mg/kg，Control组、LPS组使用等量0.9%氯化钠溶液腹腔注射。

1.3 肺组织的检查 剪取右肺上叶小鼠肺组织称质量，然后放入50 ℃烤箱中72 h，再次称质量，计算肺湿/干重比（W/D），以评价肺组织的水肿程度。化学比色法测定肺组织中MPO活性，具体操作严格按试剂盒操作说明进行。取左肺门旁0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的组织2～3块，4%多聚甲醛固定，行石蜡包埋、切片，Power tome-XL型超薄切片机切片，日立H-7500型透射电镜观察。

1.4 TNF-α、IL-6和ICAM-1的检测 造模24 h后，予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，开胸，结扎小鼠左主支气管，取左肺。颈部分离气管进行插管后，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）灌洗右肺3次，1 mL/次，回收率大于80%。将回收的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）离心后分别获得上清。用ELISA法检测TNF-α、IL-6和ICAM-1的浓度。

1.5 统计学处理方法 采用SPSS22.0统计软件对数据进行处理。数据均以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，方差不齐采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织W/D和MPO含量的变化 LPS组小鼠肺组织W/D较Control组升高，差异有统计学意义（P＜0.01），表明存在肺水肿。Endocan组小鼠肺组织W/D较LPS组降低，差异有统计学意义（P＜0.01），提示Endocan能减轻ALI时肺的含水量。LPS组小鼠肺组织中的MPO活性较Control组明显增高（P＜0.01），Endocan组小鼠肺组织中MPO活性较LPS组减低（P＜0.01）。见图1。

图1 各组小鼠肺组织W/D和MPO的变化

2.2 肺组织超微结构改变 Control组：毛细血管内皮细胞结构正常，连接紧密，基底膜完整；I型肺泡上皮细胞正常；II型肺泡上皮细胞结构完整；线粒体嵴清楚，微绒毛无减少，板层小体数量未见改变（见图2A）。LPS组：毛细血管内皮细胞肿胀，连续性中断，基底部变窄，呈拱桥状或高柱状向腔内突出，部分脱落；I型肺泡上皮细胞内吞饮小泡较少；II型肺泡上皮细胞表面微绒毛稀疏，线粒体肿胀明显，板层小体稀少空泡化，肺泡隔水肿，肺泡隔及毛细血管内见大量以中性粒细胞为主的炎症细胞附着（见图2B）。Endocan组：毛细血管和肺泡结构有所改善，毛细血管内炎症细胞减少，染色质分布较均匀；I型肺泡上皮细胞内吞饮小泡较多；II型肺泡上皮细胞表面微绒毛及板层小体增多；肺泡隔轻度水肿（见图2C）。

2.3 小鼠BALF中TNF-α、IL-6和ICAM-1的水平 与Control组比，LPS组TNF-α、IL-6和ICAM-1水平均明显升高（P＜0.01），经过Endocan干预后，Endocan组TNF-α、IL-6和ICAM-1水平均较LPS组降低（P＜0.01）。见图3。

图3 各组小鼠BALF中TNF-α、IL-6和ICAM-1水平的变化

3 讨论

ALI/ARDS是由肺内外因素导致的肺组织病理损伤、肺泡血管屏障破坏、炎症反应和肺脏生理功能异常。肺是脓毒血症的易损器官之一，内毒素促进大量炎症细胞因子产生，引起肺内中性粒细胞（polymorphonuclear，PMN）的聚集和激活，是造成ALI的重要原因。本研究观察到LPS组小鼠肺组织W/D明显增高，电镜下观察到肺毛细血管内皮、I型肺泡上皮细胞、II型肺泡上皮细胞、线粒体和板层小体等肺超微结构损伤改变，肺泡隔及毛细血管内见大量以PMN为主的炎症细胞附着；与Control组比，肺泡结构损伤严重，间质水肿、炎性细胞浸润和出血等情况均显著增加，进一步证实雾化吸入LPS致小鼠ALI的模型有效可行。

目前炎症反应机制在内毒素性肺损伤中的研究越来越受到大家的关注，ALI是由于机体炎症反应失控导致的综合征，表现为促炎因子的明显升高，抑炎因子的下降以及凝血纤溶系统失衡为特征。参与这些炎症反应的包括PMN、血管内皮细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞等，其中PMN、单核巨噬细胞等在ALI中发挥了重要作用。在内毒素性肺损伤时，PMN聚集、活化和释放炎性介质，其关键为PMN通过ICAM-1与内皮细胞相互黏附，介导炎症反应导致释放多种细胞因子，引起免疫应答形成网络连锁反应，使血管内皮细胞受损导致稳态失衡[7]，内皮功能的快速变化激活凝血系统，微血栓形成引发血液流变学的变化，导致组织缺血缺氧引起器官衰竭[8]。本研究显示，雾化吸入LPS后小鼠血清TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1水平均显著升高，我们推测毛细血管内皮细胞损伤后，分泌大量黏附分子和趋化因子等，从而促进PMN、巨噬细胞等炎症细胞向炎症部位聚集，在内毒素性肺损伤中发挥重要作用，与文献报道[9]一致。

Endocan又称内皮细胞特异性分子-1，在正常人体内主要由肺、肾脏血管内皮细胞分泌[10]。Endocan是淋巴细胞相关抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）的一个特异性配体，它可以与LFA-1结合，通过对LFA-1与ICAM-1竞争性抑制作用，阻止PMN在内皮细胞黏附[11]，Endocan具有非常广泛的生物学活性，可能通过多种信号传导途径，参与体内黏附分子介导的细胞迁移、细胞黏附、炎症反应、血管生成、促进细胞增殖和分化、肿瘤的发生与发展等过程[12-13]。过去大量研究表明，Endocan与人类多种恶性肿瘤密切相关[14-16]，新近有研究发现，在ARDS早期Endocan水平升高反映病情的严重程度，并预测不良的演化，如死亡或对机械通气的长期依赖，提示Endocan可能成为预测其发生率和病死率的重要指标[17-19]。MIKKELSEN等[20]报道了严重创伤后ALI患者血清Endocan没有升高，而是处在低水平状态，推断Endocan的分泌不足导致肺组织过度炎症反应使肺损伤加重。本研究采用外源性Endocan来干预小鼠内毒素性肺损伤，结果发现与LPS组比，Endocan组小鼠肺组织W/D和MPO活性降低（P＜0.01），BALF中TNF-α、IL-6和ICAM-1水平均降低（P＜0.01），肺组织超微结构改变显著减轻。由此，我们认为Endocan能够降低LPS诱导的小鼠ALI时MPO活性和ICAM-1的水平，推断Endocan可能通过调控PMN从血液到组织的迁移及特异性免疫应答过程，抑制LFA-1/ICAM-1的相互结合，从而阻止PMN通过血管壁随意迁移，减少PMN向炎症部位聚集，减轻肺组织损伤，从而在内毒素性肺损伤中起器官保护作用。

综上所述，Endocan可减轻LPS诱导的ALI小鼠肺组织的炎症反应，提示Endocan在ALI时具有保护作用。值得注意的是，Endocan的分泌不足或过度分泌均可导致组织器官的损伤，而Endocan分泌可能是炎症反应过程中机体的负反馈调节，其过度分泌可导致机体免疫保护作用受到限制，继而加重ALI，故Endocan在ALI中的作用机制有待于在以后的研究中进一步探索。