黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭免疫性能、抗氧化性能以及肠道形态的影响

2018-10-17赵文文袁文华沈军达袁慧坤李国勤卢立志刁新平

动物营养学报 2018年10期

赵文文袁文华沈军达袁慧坤王源李国勤,3 卢立志,3* 刁新平*

(1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030；2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州310000；3.农业部农产品信息溯源重点实验室，杭州310021)

抗生素和防病促生长的化学药物作为饲料添加剂在畜禽生产中得到了广泛的使用，虽然抗生素的使用可以增强畜禽的生长能力,对畜禽的疫病方面的防控和治疗都起到了一定的促进作用，但是抗生素的大量使用会造成畜禽体内细菌的耐药性增强、畜产品中抗生素的残余量增大,从而破坏肠道内的微生物平衡[1-2]，另外还会造成耐药菌的扩散、超级细菌的产生等[3]，这些都直接或间接危害到了人类的健康。黄芪多糖(Astragaluspolysaccharides，APS)是中药黄芪的主要成分之一，柳志余[4]研究表明，黄芪多糖具有调节机体免疫功能的作用。Chen等[5]研究证实，黄芪多糖不仅能提高动物生长性能，还能增强机体免疫力。肖娅楠[6]试验表明，饲粮中添加黄芪多糖可促进肉鸡生长，提高免疫器官指数。微生态制剂是一种能调整并维持畜禽肠道菌群平衡的、促进生长发育增强机体免疫力的、新型的绿色无公害添加剂[7]。有研究表明，适当浓度的黄芪提取液对益生菌能起到一定的促生长作用[8]。岑路等[9]研究表明，益生菌和黄芪多糖有很明显的协同作用。本试验在饲粮中添加黄芪多糖、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)及其复合剂，旨在探讨其单独添加与复合添加对蛋雏鸭免疫性能、抗氧化性能和肠道形态的影响，为其在蛋鸭养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄芪多糖和杆菌肽锌(Bacitracinzinc)由西安泽邦生物科技有限公司提供(黄芪多糖纯度为60%，杆菌肽锌纯度为10%)，丁酸梭菌由湖北绿雪生物科技有限公司提供(活菌数量≥2×108CFU/g)。

1.2 试验设计与基础饲粮

试验选取1日龄、健康、体重相近的蛋雏公鸭600只，随机分成5组，每组6个重复，每个重复20只鸭。蛋鸭基础饲粮参照NRC(1998)营养标准和台湾畜牧学会(1993)标准中产蛋鸭需要量配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。Ⅰ组为对照组，饲喂基础饲粮；Ⅱ组(抗生素组)在基础饲粮的基础上添加40 mg/kg的杆菌肽锌，Ⅲ组在基础饲粮的基础上添加800 mg/kg的黄芪多糖，Ⅳ组在基础饲粮的基础上添加250 mg/kg的丁酸梭菌，Ⅴ组在基础饲粮的基础上添加800 mg/kg的黄芪多糖+250 mg/kg的丁酸梭菌。

1.3 饲养管理

试验在浙江省绍兴市王府井镇国伟禽业有限公司养殖基地进行，饲养期为28 d。试验鸭在网上散养，自由采食和饮水，第1周饮用温开水，第2周开始饮用室温下放置4～5 h的冷水，一定要保证水的充足和清洁。试验期内的光照制度为自然光照与人工光照相结合，育雏期第1周光照时间为24 h；第2～3周的光照时间逐渐过渡到16 h；从第4周开始为自然光照。使用自动控温仪设备控制舍内的温度。保证每天洗刷水槽、料槽和类板1次，搞好鸭舍环境卫生，避免惊吓和干扰，每日仔细观察试验鸭的精神状况，观察釆食饮水和类便是否有异常、是否有病死鸭等。按常规方法和程序进行饲养和免疫。

1.4 样品的采集和处理

在试验第28天从每个重复中随机抽取接近平均体重的蛋雏鸭2只进行称重并记录，然后进行颈静脉采血，3 500 r/min离心15 min分离血清分装于EP管中，-20 ℃保存备用。采血后将鸭全部放血处死，摘取肝脏(不包括胆囊)封袋，-20 ℃冰柜中保存备用；摘取免疫器官(脾脏、胸腺、法氏囊)，去除结缔组织和脂肪，用电子分析天平称重并记录；取十二指肠、空肠、回肠中央位置组织各2 cm左右，在生理盐水内清洗后置于中性缓冲福尔马林(pH 7.4)溶液中固定，用于苏木精-伊红(HE)染色。试验所需所有工具都经高压灭菌处理，并用75%酒精擦拭桌面以去除环境样品微生物污染。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1)微量元素预混料和维生素预混料为每千克饲粮提供 The microelement premix and vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 4 000 IU，VB13.5mg，VB25.5 mg，吡哆醇 pyridoxol 2.5 mg，VB120.01 mg，VD31 500 IU，VK22 mg，生物素 biotin 0.10 mg，叶酸 folic acid 1.0 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 10 mg，烟酸 nicotinic acid 50 mg，Cu 10 mg，Fe 80 mg，Mn 60 mg，Zn 60 mg，I 0.40 mg，Se 0.20 mg。

2)代谢能为计算值，其余为实测值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.5 测定指标及方法

1.5.1 血清免疫指标

用比色法测定血清中的免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和补体3(C3)、补体4(C4)含量，采用A6半自动生化仪进行测定，试剂盒由北京华英生物技术有限公司提供。

1.5.2 免疫器官指数

免疫器官(胸腺、脾脏、法氏囊)指数(g/kg)=免疫器官鲜重/宰前空腹活重。

1.5.3 血清和肝脏的抗氧化指标

参照试剂盒说明书测定血清和肝脏中的总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，采用A6半自动生化仪进行测定，试剂盒由北京华英生物技术有限公司提供。

1.5.4 肠道形态

将固定好的十二指肠、空肠、回肠各段组织经脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、展片、粘片及HE染色，封固后每组内每张切片挑选40倍视野进行拍照，测定绒毛高度(VH)、隐窝深度(CD)，计算绒毛高度/隐窝深度(VH/CD)值。

1.6 数据统计分析

试验数据经Excel 2007进行初步的处理，用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较检验。结果用“平均值±标准误”表示，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭血清免疫指标的影响

如表2所示，Ⅲ组、Ⅴ组的血清IgA含量与Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组之间差异显著(P<0.05)，Ⅲ组和Ⅴ组的血清IgA含量相对于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组分别提高了9.55%、7.92%、6.86%和13.07%、11.39%、10.29%；Ⅴ组的血清IgM含量相对于Ⅱ组提高了32.14%(P<0.05)；Ⅴ组的血清IgG、C3和C4的含量都高于其他各组，但差异不显著(P>0.05)。

表2 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭血清免疫指标的影响

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭免疫器官指数的影响

如表3所示，Ⅴ组的胸腺指数相较于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别提高了45.32%、27.59%、25.59%、22.70%(P<0.05)，Ⅳ组相较于Ⅰ组也提高了18.43%(P<0.05)，而Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05)；Ⅳ组、Ⅴ组的脾脏指数相较于Ⅰ组、Ⅱ组分别提高了20.41%、19.19%和11.22%和10.10%(P<0.05)；Ⅴ组的法氏囊指数明显高于其他各组，但差异不显著(P>0.05)。

2.3 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭血清和肝脏抗氧化指标的影响

如表4所示,在第28天，血清抗氧化指标方面，Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组的T-AOC分别较Ⅰ组提高了50.17%、47.67%、90.03%(P<0.05)，Ⅴ组较Ⅱ组提高了68.48%(P<0.05)；Ⅳ组的MDA含量较Ⅰ组降低了43.71%(P<0.05)；Ⅴ组的GSH-Px活性相较于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别提高了80.53%、60.08%、25.97%、29.70%(P<0.05)；Ⅴ组的T-SOD活性分别较Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别提高了67.48%、63.14%、21.69%、26.48%(P<0.05)。

表3 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭免疫器官指数的影响

肝脏抗氧化指标方面：Ⅴ组T-AOC相较于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别提高了90.00%(P<0.05)、68.89%(P<0.05)、26.67%(P>0.05)、27.73%(P>0.05)；而Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组之间的差异不显著(P>0.05)；Ⅳ组MDA含量相对于Ⅰ组下降了43.66%(P<0.05)，而Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅴ组之间差异不显著(P>0.05)；Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组GSH-Px活性相较于Ⅰ组、Ⅱ组分别提高了54.48%、51.69%、59.62%和46.72%、44.07%、51.60%(P<0.05)，而Ⅳ组与Ⅲ组和Ⅴ组之间、Ⅱ组与Ⅰ组之间差异不显著(P>0.05)；Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组T-SOD活性相较于Ⅰ组、Ⅱ组分别提高了74.34%、89.95%、90.26%和45.17%、58.17%、58.43%(P<0.05)，而Ⅲ组与Ⅳ组与Ⅴ组之间、Ⅱ组与Ⅰ组之间差异不显著(P>0.05)。

2.4 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭肠道形态的影响

如表5所示，Ⅰ组十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度与其他各组之间差异不显著(P>0.05)。Ⅴ组十二指肠的隐窝深度相较于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组分别降低了11.04%、10.48%、9.96%(P<0.05)；Ⅳ组、Ⅴ组空肠的隐窝深度相较于Ⅰ组分别降低了21.10%、28.06%(P<0.05)；Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组回肠的隐窝深度相较Ⅰ组、Ⅱ组分别降低了48.29%、14.56%、47.68%和31.84%、34.37%、33.60%(P<0.05)，Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组之间差异不显著(P>0.05)。各组之间十二指肠的绒毛高度/隐窝深度值差异不显著(P>0.05)，Ⅴ组空肠的绒毛高度/隐窝深度值相较Ⅰ组、Ⅱ组分别提高了44.31%和40.00%(P<0.05)，Ⅴ组、Ⅳ组、Ⅲ组与Ⅰ组、Ⅱ组之间回肠的绒毛高度/隐窝深度值差异显著(P<0.05)。

表4 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭血清和肝脏抗氧化指标的影响

表5 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭肠道形态的影响

3 讨论

3.1 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭血清免疫指标的影响

畜禽的免疫功能主要是通过免疫因子(免疫球蛋白、细胞因子、补体)来识别和排除抗原性异物，从而保护机体内外的生理平衡。IgA、IgG、IgM是家禽体内重要的3种免疫球蛋白，而免疫球蛋白的含量也是衡量动物机体免疫机能的重要指标[10]，血清中C3、C4的含量变化是评估免疫功能好坏、疾病变化和治疗效果的重要指标。Lin等[11]研究发现，黄芪多糖可促进树突状细胞的成熟；王海凤等[12]研究发现，饲粮中添加适宜浓度的黄芪多糖可以提高机体IgA、IgG、IgM的含量，从而增强了畜禽的免疫力；Yang等[13]研究发现，丁酸梭菌能够提高肉鸡血清IgA、IgG、IgM的含量；郑有秀等[14]研究发现，饲粮中添加丁酸梭菌可以提高断奶仔猪的血清IgA、IgG含量；邹知明等[15]研究表明，黄芪多糖和益生菌互作可以显著促进肠道IgA的分泌；黄克宏等[16]研究表明，苏氨酸与黄芪多糖、益生菌在调节机体免疫方面具有显著的协同效应。本试验结果表明，在试验第28天，Ⅴ组(复合剂组)的血清IgA含量显著高于其他各组，血清IgM、IgG、C3、C4含量与其他各组虽差异不显著，但均有明显提高的趋势，这是因为丁酸梭菌和黄芪多糖的互作更好地促进了肠道对黄芪多糖的吸收，使其免疫指标的含量在一定程度上升高，共同提高了机体的免疫性能。

3.2 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭免疫器官指数的影响

动物自身免疫细胞生长发育和分裂增殖可导致免疫器官的重量增加，进而提高机体的免疫功能。王虹玲等[17]在试验中用免疫器官指数作为雏鸡免疫功能强弱的重要指标。免疫器官指数可以反映出机体的免疫性能的高低[18]。许多研究表明，黄芪多糖可以促进机体免疫器官发育，显著提高免疫器官指数[19-20]；贾志新[21]研究表明，饲粮中添加不同水平的丁酸梭菌可显著提高21日龄肉鸭的胸腺指数和脾脏指数；吕鑫[22]研究表明，益生菌和黄芪多糖的互作可以提高海兰褐蛋鸡的免疫器官指数；赵云焕等[23]研究表明，益生菌和黄芪多糖的互作可以显著提高固始鸡的免疫器官指数；邹知明等[15]研究表明，黄芪多糖和益生菌的互作可以维持肠道健康，不仅能显著抑制肠道大肠杆菌的数量，还能增加乳酸杆菌的数量。本试验结果表明，在试验第28天，Ⅴ组胸腺指数和脾脏指数显著高于Ⅰ组和Ⅱ组，而法氏囊指数与其余各组差异并不显著，但Ⅴ组的法氏囊指数也均高于其他各组，这说明饲粮中添加黄芪多糖-丁酸梭菌复合剂对免疫器官的生长起到促进的作用，这也许是黄芪多糖进入动物肠道内调节了微生物生存的环境，与丁酸梭菌互作使得有益菌大量繁殖，有害菌的数量大幅度降低，进而使得有益菌的代谢物在肠道内产生氨基酸、有机酸、维生素等营养物质[24]，进而促进免疫器官的生长，试验说明了黄芪多糖-丁酸梭菌复合剂能有效促进蛋雏鸭免疫器官的生长。

3.3 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭血清和肝脏抗氧化指标的影响

GSH-Px在畜禽内的主要作用是减轻有机氨过氧化物对机体的损害、消除脂类氨过氧化物以及同超氧化物歧化酶(SOD)一起共同保护机体细胞的健康[25-26]。畜禽体内的MDA含量越高，说明过氧化反应越强烈，也反映出了机体细胞受损伤程度越大。孙波等[27]和陶浩[28]都研究发现，黄芪多糖具有增强免疫和抗氧化的功能。左兆云等[29]研究表明，在蛋鸡饲粮中添加100～300 mg/kg黄芪多糖可以使蛋黄中SOD活性升高，MDA含量降低。郑嫩珠等[30]研究表明，饲粮中添加黄芪多糖可以使机体内SOD、GSH-Px活性和T-AOC升高，MDA含量降低。贾志新[21]研究表明，饲粮中添加丁酸梭菌可以不同程度提高樱桃谷肉鸭血清中抗氧化指标，提高机体的抗氧化能力。本试验结果表明，在试验第28天，试验组血清和肝脏中的T-AOC及T-SOD、GSH-Px活性均高于对照组和抗生素组，且Ⅴ组均最高，说明黄芪多糖和丁酸梭菌复合添加较单一添加更能提高机体的抗氧化能力；试验组血清和肝脏中的MDA含量均低于对照组和抗生素组，且添加丁酸梭菌组降低MDA含量的能力较强，也许是丁酸梭菌在肠道内定值，破坏了机体内的氧化反应所需要的物质，使得机体的抗氧化能力增强。

3.4 黄芪多糖和丁酸梭菌对蛋雏鸭肠道形态的影响

小肠是畜禽吸收营养物质的主要场所，肠绒毛的高度变高和隐窝深度变浅都会増加机体肠道对营养物质的消化吸收，从而提升动物的生长性能。而小肠绒毛高度/隐窝深度值也可以用来反映小肠的吸收功能，其比值越高，表示肠绒毛对营养物质的吸收越强。陶浩[28]研究发现，饲粮中添加黄芪多糖可以提高肉仔鸡十二指肠的绒毛高度，降低隐窝深度；赵熙等[31]研究发现，丁酸梭菌活菌制剂可以促进肠道有益菌增殖，抑制有害菌增殖；邹知明等[15]研究表明，黄芪多糖和益生菌互作可以有效增加肠绒毛的长度和宽度。本试验结果表明，黄芪多糖和丁酸梭菌复合添加相较于单独添加能更有效地降低蛋雏鸭十二指肠、空肠和回肠的隐窝深度，提高了空肠和回肠的绒毛高度/隐窝深度值，也在一定程度上提高了十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度以及十二指肠的绒毛高度/隐窝深度值，这可能是黄芪多糖和丁酸梭菌互作使肠道内的有益菌数量增多，有害菌数量减少，而丁酸梭菌的主要代谢产物又是丁酸，对肠道上皮细胞的组织和再生起着很大的作用，所以两者互作改善了肠道的形态。