好氧砷还原菌对砷与铁还原释放的影响

2018-10-17

福建质量管理 2018年18期

(湖南师范大学湖南长沙 410006)

As是一种类金属，自然界中的As有存在着很多不同的化学形态，它在环境中的赋存形态及其迁移转化过程很大程度上决定了其毒性[1]。环境中的无机砷的主要存在形式包括+3价的亚砷酸盐和+5价的砷酸盐[2]，As(III)的毒性和迁移性高于As(V)。As(V)能稳定存在于土壤中，它在土壤的各种吸附过程中能与矿物组分共沉淀，与As(V)不同的是As(III)则不易在土壤介质中形成沉淀[3]。微生物在砷的形态转化过程中扮演着重要角色，也在砷的地球化学过程中起到关键性作用[3-4]。在好氧条件下，34微生物通过细胞内As(V)还原酶arsC将As(V)还原为As(III)，再由As(III)运载蛋白arsB/acr3将其排出体外[5]。这类通过解毒机制进行砷还原的微生物叫做细胞质As(V)还原微生物。这类微生物能将易吸附于钙、铁、铝等矿物质上的As(V)还原为移动性和毒性更强的As(III)，是好氧环境中参与砷活化和释放的重要微生物类群[6-7]。

As和Fe的相互作用对As在环境中的行为具有重要意义。在自然环境中，主要有两类矿物会富集As：一类是硫化物矿物，还有一类是铁氧化物矿物[8]。由于铁氧化物矿物具有对As有较高的亲和力，Fe元素和As素也是相互影响，相互作用，因而吸附了As的铁氧化物常常被用来用于实验研究。探讨还原菌体、含Fe矿物参与的As迁移转化过程有助于理解环境中As、Fe、微生物三者共同参与下的循环过程，也能帮助我们更好地理解As和Fe的地球化学作用[9]。

目前，很多研究主要是关于厌氧微生物对As(V)迁移转化影响[10-11]，而在实际土壤环境中，土壤表层含氧量较高，存在有很多好氧微生物[12]，而关于这些好氧微生物(如好氧As(V)还原菌)对As(V)的迁移转化研究很少。另一方面，不少的研究采用的是模拟体系，如用石英砂来模拟实际土壤环境，而对于实际土壤环境中As在微生物作用下的迁移转化的研究有限，因此，本实验是探究在好氧条件下As(V)还原菌对铁氧化物吸附态As(V)及土壤中结合态As(V)的迁移转化的影响[13]，研究石门雄黄矿区高As壤中耐As土著微生物的生长化学特征、土著微生物对不同价态As的氧化还原作用，是为了让我们更好的理解耐As土著微生物在As的迁移转化中所起的作用，也为了让我们更好的研究高As土壤的As释放过程，同时对丰富As的迁移转化过程提供了参考价值

一、实验材料与方法

(一)样品来源

供试土壤为取自湖南石门县雄黄矿区As污染土，采样点是矿区小门卫前地块。土样采集后经风干、研磨后4℃冰箱保存备用.土壤基本元素含量用北京海光仪器LC-AFS 6000测定了采样点的土壤总As含量，其余元素使用原子吸收光谱仪(Agilent 240 AA)测定。

水铁矿的制备是根据Schwertmann提出的方法制备[14]。

表1 土壤基本元素含量表

(二)培养基的制备

分离菌株采用LB培养基：5g L-1酵母膏，10g L-1胰蛋白胨，10g L-1Na Cl,PH为7.4，培养基中加入固体Na2HAsO4·7H2O使得溶液中As(V)的总浓度为200 mg L-1。

固体培养基需在此基础上加入20g琼脂粉即可。

二、

(一)实验方法

1.好氧As(V)还原菌的分离与鉴定

在富集耐As(V)微生物的土样中取1g新鲜土壤放置于100m L无菌锥形瓶中(高压灭菌)，加入30ml 200 mg/L无菌As(V)溶液，置于30 ℃，200 r/min摇床中振荡24 h后，取上清液按10-2-10-5梯度稀释涂布于LB平板。平板置于30 ℃恒温培养箱内培养2天，挑取单菌落，反复于平板上划线纯化至获得耐As(V)纯菌。将纯菌株放于4 ℃冰箱保存以备后续实验使用。将得到的耐As(V)菌接种到200 mg/L As(V)浓度的液体培养基过夜培养，培养条件为200r/min，30℃摇床培养。取菌液过0.22 μm微孔滤膜，上级检测As形态，所用仪器为原子荧光-高效液相色谱联用仪(北京海光仪器LC-AFS 6000)，将出现一定浓度As(III)的菌株进行标记，筛选出5株具有较强As(V)还原能力的菌株用于后续实验。

实验采用16S r RNA基因序列分析法，鉴定所分离出的As(V)还原菌株。具体方法为：采用FastDNA® Spin Kit for Soil(土壤基因组DNA提取试剂盒)提取分离得到的纯菌株的DNA，并以其DNA为模版对菌株的16S r RNA基因进行PCR扩增，PCR扩增后使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，随后进行PCR产物的纯化与16S r RNA基因测序(湖南擎科)。

2.好氧As(V)还原菌体内的As(V)还原酶基因扩增分析

该实验以分离得到的纯菌株经过提取后的DNA为模版，以引物P52F和P323R对As(V)还原酶基因arsC进行PCR扩增，扩增引物为P52F和P323R[15]。

3.好氧As(V)还原菌的耐As能力分析

实验中采用LB培养基，As(V)浓度As(V)为分别为200 mg/L和2 mg/L,研究五株As(V)还原菌SM4，SM9，SM12,SM14,SM15分别在200 mg/L和2 mg/L As(V)溶液中的生长情况。设置空白对照组(不加微生物)，实验组菌液与培养基比例为1 m L：50 m L，空白组用无菌超纯水取代菌液，反应条件均为30℃，200 rpm 振荡培养。设置时间梯度为4h，6h,14h,16h,18h,20h。在不同时间段测定OD600值(紫外可见分光光度计，上海精科752N)[16]。

(1)好氧As(V)还原菌对液相As(V)的还原转化

实验中采用LB培养基，As(V)浓度为200 mg/L,设置空白对照组(不加微生物)，实验组菌液与培养基为1 m L：50 m L，空白组用无菌超纯水取代菌液。反应条件均为30℃，200 rpm振荡培养24h。将样品过0.22μm微孔滤膜，用北京海光仪器LC-AFS6000测定As形态。

(2)好氧As(V)还原菌对水铁矿吸附态As(V)和Fe(Ⅲ)的转化

在前面的液相实验中，五株菌株都具有较强的As(V)还原能力，从中选取了一株具代表性的菌株，即SM14，进行接下来的水铁矿吸附态As(V)的转化实验。

实验过程为1ml培养液离心(15000g，10min)，得到沉淀用灭菌的0.8%的Na Cl溶液清洗，再溶到1mL Na Cl溶液中得到1ml细胞悬浮液，加到19ml无菌水中，后加入0.05g吸附As(V)后的水铁矿。实验设置两个对照，一个为不加水Fe(Ⅲ)矿的阴性对照，另一个为不接种As(V)还原菌的空白对照。空白组用无菌超纯水取代菌液。反应条件均为30℃，200 rpm振荡培养24h。将样品过0.22μm滤膜，用北京海光仪器LC-AFS6500测定As形态，用紫外可见分光光度计测定Fe形态。

(3)好氧As(V)还原菌对As污染土壤中的As(V)和Fe(Ⅲ)转化

将石门取回的新鲜土壤反复三次高压灭菌，取1g灭菌土与19ml灭菌水制成土壤悬浮液。1ml培养液离心(15000g，10min)，得到沉淀用灭菌的0.8%的Na Cl溶液清洗，再溶到1mlNa Cl溶液中得到1ml细胞悬浮液，加到19 ml的土壤悬浮液中，空白组用无菌超纯水取代菌液，30℃，200 rpm振荡培养，培养一定间隔时间取样测定As形态和Fe形态。另取一份相同土壤经过同样处理静置培养7天。将样品过0.22μm滤膜，用北京海光仪器LC-AFS6000测定As(V)形态，用紫外可见分光光度计测定Fe形态。

图2-2 包含菌株SM4,SM9,SM12,SM14,SM15在内的系统发育树

(二)结果与讨论

1.好氧As(V)还原菌的鉴定结果

将测序结果用BLAST数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行对比鉴定。经比对鉴定，分离出五株As(V)还原菌株，它们都属于芽孢杆菌属，与Bacillus序列相似度达99%，分别命名为SM4,SM9,SM12,SM14,SM15。得到的对应的NCBI数据库编号分别为1937185，1937190，1937193，1937196，1937199。类似地，陈倩等人用琼脂平板培养法从湖南石门县雄黄矿区土壤中筛选出43株耐As(V)细菌。其中27.91%属于芽孢杆菌属Bacillus sp.[17]。

测序结果经过软件Contig Express拼接之后得到拼接序列，Crustal X软件align之后，用Mega软件构建出系统发育树，采用方法为neighbor-joining方法，步点值(Boot straps)为1000。该发育树结果表明得到的五株好氧As(V)还原菌株SM 4,SM 9,SM 12,SM 14,SM 15与芽孢杆菌属的关系最近，但分属于不同的种。

2.好氧As(V)还原菌体内的As(V)还原酶基因的鉴定

将测序结果用BLAST数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行对比鉴定。经比对鉴定，五株As(V)还原菌内均有As(V)还原酶基因，且该还原酶基因属于arsC基因。很多研究表明和Bacillus sp.具有As(V)操纵子arsC，这一基因编码了As(V)还原酶，在As(V)到As(III)的生物转化过程中具有重要作用[18]。这与我们的实验结果也是一致的，实验中我们检测到了arsC编码基因的存在，片段大小为275bp左右。

3.好氧性As(V)还原菌的耐As能力分析

图2-3(左)给出了菌株在As(V)浓度为200 mg/L的溶液中菌株的生长情况，CK为无接种微生物对照。由图可以看出，菌株SM 12，SM 15大致在10 h后开始对数生长期并在14 h时达到最大生长量，菌株SM 4，SM 9，SM 14大致在14 h后开始对数生长期SM 14在18 h达到最大生长量，SM 4，SM 9在20 h达到最大生长量。而CK检测不到菌株的生长。图2-3(右)给出了菌株在As(V)浓度为2 mg/L的溶液中菌株的生长情况。同样地CK为无接种微生物对照。由图可以看出，五株菌株在6 h后开始对数生长期并在10 h时左右达到最大生长量，说明高As(V)浓度下菌株生长比低As(V)浓度情况下缓慢，但24 h后不同As浓度胁迫下菌株的生长量基本持平，无显著差异。

图2-3 200mg/L(左)和2 mg/L(右)As(V)溶液体系中CK以及菌株SM 4，SM 9，SM 12,SM 14,SM 15的生长情况

Figure2-3ThegrowthofCKandstrainSM4,SM9,SM12,SM14,SM15in200mg/Land2mg/LAs(V)solutionsystem

(1)好氧As(V)还原菌对液相As(V)的转化

如图3-2所示，实验结果表明，五株菌株均可以在200 mg/L As(V)溶液中生长，并且都能将As(V)还原成As(III)。随着培养时间的增加，As(V)浓度慢慢降低，As(III)浓度慢慢升高，并且菌株的生长量是跟其还原量同步的，在菌株大量增长的对数生长期，其As(V)还原速率也是最快的。五株菌株基本能够在24h内将200 mg/L As(V)完全还原As(III)。其中10-20h是一个快速还原时期，这可能是由于菌株逐渐达到了较大生长量，还原能力不断增强，此结果与图2-2表现出的菌株生长规律一致。五株菌株SM4,SM9,SM12,SM14,SM15的As(V)还原量相差无几，都能达到200 mg/L，但是达到最大还原量所需的时间分别是18h，24h，16h，20h，24h，显然菌株SM12的还原速率最快。As(III)的最大值低于起始的200 mg/L As(V)浓度值可能是因为部分As(III)存在于菌株的细胞液中，暂未释放到溶液中。

过本章的液相As溶液实验，可以知道我们所得到的五株好氧型As(V)还原菌能够在200 mg/L的As(V)溶液中生长并且能够将As(V)全部还原成为As(III)，随着培养时间的增加，还原效率降低，一方面是因为菌株经过了对数生长期并且逐渐衰亡，其还原能力下降，另一方面，随着As(III))浓度的升高，溶液中的毒性不断增强，抑制了菌株的生长，这点与前面提到的As(III)毒性高于As(V)结论一致。

图3-2好氧还原菌SM4,SM9,SM12,SM14,SM15以及CK对液相As(V)的还原转化

Fig.3-2TransformationandreductionofarsenicbyaerobicarsenicreducingbacteriaSM4,SM9,SM12,SM14,SM15andCKinliquidAs(V)

(注：每个小图左上角SM4,SM9,SM12,SM14,SM15，CK为菌株名称)

(2)好氧As(V)还原菌对水铁矿吸附态As(V)的还原转化

在水铁矿吸附态As(V)(200 mg/L)的实验中，收集到的上清液仅为98.46 ug/L，这足以说明水铁矿对As(V)具有强大的吸附能力，吸附效率高达99.95%。并且吸附所需的时间仅为24 h，这也说明水铁矿对As(V)具有很强的亲和力，这与前面提到的铁氧化物与As具有密切关系观点一致。这也是本文为何选取水铁矿作为吸附材料的原因。

在0-10h内，As(V)浓度逐渐下降，As(III)浓度逐渐上升，这意味着在此期间As(V)快速被还原成As(III)，10 h即可达到最大As(V)还原量，即As(III)浓度达到了最大值66.72μM(即4.998 mg/L)。并且As(III)浓度达到的最大值远大于As(V)的最大浓度值。由此可以说明，在此期间，As(V)还原菌株SM14还原了部分吸附在水铁矿表面的固相As(V)。此时Fe(II)也达到了一个较高值1.168 mM(即65.408 mg/L)。而CK组在0-10 h内As(V)浓度由33.16 mg/L下降到26.42 mg/L，这个值远低于实验组的As(III)浓度值。并且在CK溶液中检测不到As(III)的存在，如图3-3(2)所示。此时溶液中也出现了部分Fe(II)。

如图3-3(1)所示在10-72h时间段内，实验组As(III)浓度有所下降，As(V)浓度有所上升，这可能是因为被还原到液相中的As(III)又被吸附到水铁矿的表面，因为水铁矿对As(V)具有强大的吸附能力。Fe(II)浓度则呈现一种缓慢上升的状态。而CK组中As(V)浓度虽然有微小的上升阶段，最终也恢复到与起始浓度值持平的状态，Fe(II)浓度则呈现一种相对稳定的状态，溶液中始终没有检测到As(III)，如图3-3(2)所示。

图3-3 好氧还原菌SM14(a)和CK(b)对水铁矿吸附态As(V)的还原转化

Fig.3-3ReductionandtransformationofadsorptivearseniconferrihydritebyaerobicarsenicreducingbacteriaSM14(left)andCK(right)

3.好氧As(V)还原菌对土壤As(V)和Fe(Ⅲ)的转化

如图3-4 B和D所示，在灭菌组中，接种好氧As(V)还原菌株的样品As(III)浓度和Fe(II)浓度值明显比未接种样品As(III)浓度和Fe(II)浓度高，未接种处理中As(III)浓度几近为零，(As(V)形态的检测限为0.05 ug/L)，对比之下，接种好氧As(V)还原菌的处理样品中As(III)浓度最大值达到了82.46 ug/L，Fe(II)浓度也达到了74.21 mg/L，SM14对土壤中的As(V)和Fe(III)起到了明显的还原作用。

如图3-4 A所示，原始无处理样品(未接种未灭菌)，出现了一定浓度的As(III)，As(V)，Fe(III)，Fe(II)，而灭菌样品中检测不到As(III)的出现，说明As(III)的出现与土壤中的土著微生物关系密切。如图3-4 A和C所示，在未灭菌组中，接种好氧As(V)还原菌株SM14的样品As(III)浓度值也比未接种样品As(III)浓度高，Fe(II)浓度值也比未接种样品Fe(II)浓度高。说明好氧As(V)还原菌株SM14促进了As(V)和Fe(Ⅲ)的转化。接种组中As(III)和Fe(II)的浓度随培养时间的增加慢慢，说明还原过程一直在持续进行。

图3-5表明，经过七天的培养时间，As(V)还原菌株SM14明显促进了As(V)的溶出与还原。在灭菌组中，经过7天时间的培养，最大As(III)还原量达到3524.96 ug/L，而其对照组仅仅为24.19 ug/L，还原量是对照的145.7。说明接种的As(V)还原菌株SM14在As(V)还原到As(III)的过程中起到了十分重要的作用。在未灭菌组中，接种As(V)还原菌株SM14的样品As(III)浓度为2675.15 ug/L，还原量是对照的3.9倍，对照处理仅为683.45 μg/L。

图3-4 好氧还原菌SM14对土壤As(V)和Fe(III)的转化

Fig.3-4ReductionandtransformationofAs(V)andFe(III)insoilbyaerobicarsenicreducingbacteriaSM14

(注：A、C土壤未灭菌，其中A未接种菌株SM14，C接种菌株SM 14；B、D土壤进行灭菌，其中C未接种菌株SM14，D接种菌株SM14)

实验结果表明，菌株SM14对吸附在水铁矿表面的吸附态As(V)具有还原效果。在还原过程中，在无微生物加入的情况下，水铁矿也会自然溶出部分As(V)，这可能由于吸附了As(V)的水铁矿发生的化学性溶解。但加入As(V)还原菌株后，溶出量明显增加，As(Ⅲ)浓度值明显大于As(V)浓度值。这说明，As(V)还原菌株促进了As(V)的溶解，并将As(V)还原成As(III)，除了液相中的As(V)被还原，还有部分固相As(V)被还原。

图3-5静置培养7天后好氧还原菌和CK对灭菌土壤(A)和未灭菌原始土壤(B)中As(V)的还原

Fig.3-5ReductionandtransformationofAs(V)insterilesoil(A)andoriginalsoil(B)byaerobicarsenicreducingbacteriaSM14andCKafterstaticculturefor7days

在土壤实验中，不同处理都能检测到少量的Fe(II)，说明Fe(III)的还原的出现并不是由于实验添加的As(V)还原菌所引起的，灭菌处理中Fe(II)的出现可能是Fe(Ⅲ)在还原环境下发生的自然过程，也可能是在少数微生物的作用下发生的，如Fe(Ⅲ)还原菌。除了灭菌处理中没有接种As(V)还原菌的对照组没有检测到As(III)，其他处理都能检测到微量的As(III)，这是由于其他处理中都存在着微生物，这个结果也印证了As(V)的还原是在微生物参与下进行的这一观点。不管是灭菌处理还是不灭菌处理中，As(V)还原菌株的加入都使得As(III)和Fe(II)的浓度值有所增加，说明该As(V)还原菌确实能促进土壤As(V)和Fe(III)的还原。