四川地区猪源致病性大肠杆菌的分离鉴定与耐药性检测

张敏 ，李旭廷 ，王斌 ，雷昌伟 ，李思聪 ，王红宁 *

（1.四川大学生命科学学院，四川 成都 610065；2.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066）

大肠杆菌是人和动物肠道共生菌群的组成部分，部分致病性大肠杆菌能引起人和动物的腹泻、败血症等多种症状[1]。大肠杆菌在药物选择压力下，易产生耐药性，并可通过菌毛将耐药质粒传递给其他大肠杆菌，因而给大肠杆菌病的药物防控带来了较大的挑战[2]。本研究对四川地区的猪源样品进行了大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析，以期为合理使用抗生素提供依据。

1 材料

1.1 样本采集 从四川地区40个猪场采集病死猪的肠道内容物、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结、血液作为病料样本，置无菌样品袋中，冰盒保存，12h内送回实验室进行细菌分离。

1.2 试剂和标准菌株 麦康凯琼脂、营养肉汤、MH琼脂、普通营养琼脂、药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂公司；标准菌株为大肠杆菌标准株（ATCC 25922），购自中国兽药监察所。

1.3 实验动物 昆明系SPF小鼠，购自四川达硕生物技术有限公司。

2 分离鉴定方法

2.1 病料接种 无菌切取病变组织和正常组织交界处的小组织块置肉汤培养基中，37℃下增菌培养24h。然后蘸取增菌液划线于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上，37℃纯化培养24h。

2.2 菌落形态特征观察 当伊红美蓝琼脂上出现黑棕色或棕绿色且带有金属反光的菌落，或出现中心黑点、边缘灰白的表面光滑的菌落；麦康凯琼脂上出现典型红色或粉红色的光滑菌落；1000×油镜下观察为革兰氏阴性杆菌。符合以上特征的基本判定为大肠杆菌，然后作进一步的分子鉴定。

2.3 16S rDNA PCR测序鉴定[3]从伊红美蓝琼脂或麦康凯琼脂上挑取纯化后的典型单个菌落进行PCR实验，扩增细菌16S rDNA基因。引物为通用引物27F（5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,）和 1492R（5,-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3,），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件：95℃5min，95℃ 1min、50℃ 1min、72℃ 2min（30次循环），72℃ 8min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，预扩增片段1 450 bp，并由上海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序，序列结果用 NCBI BLAST搜索比对，鉴定标准按照同源性≥97%判定。

2.4 致病性试验 将鉴定了的猪源大肠杆菌接种到MH 琼脂平板，经 37℃ 24h纯培养后，用灭菌生理盐水洗下菌落，调整菌液浑浊度与0.5麦氏比浊管（1×108CFU/mL)相当，再分别腹腔注射小白鼠（0.2mL/只），每株菌同时接种3只小鼠，并设标准株 ATCC 25922为对照，观察分离菌株对小鼠的致病性。

2.5 药敏试验 菌株于MH肉汤中37℃恒温培养8～12h后，使用光度比浊仪将培养物用生理盐水稀释为0.5倍麦氏浓度。再用灭菌棉签划线接种于整个表面干燥的MH琼脂平板上，并确保每次接种均匀分布。然后用药敏纸片分散器将纸片均匀贴在琼脂平板表面，37℃恒温培养12～16h后，测量抑菌圈大小。

3 结果

3.1 细菌分离 从40个猪场采集的125个病料样品中，分离到了37株大肠杆菌，分离率达29.6%。各个脏器的分离率分别为：肠道内容物45.95%（17/37），肺脏 13.52%（5/37），淋 巴结 8.1%（3/37），肝脏10.81%（4/37），心脏 5.4%（2/37），脾脏 8.1%（3/37），肾脏 2.72%（1/37），血液 5.4%（2/37）。

3.2 致病性试验 用37株大肠杆菌攻毒小鼠后，有9株导致1只小鼠死亡，16株导致2只小鼠死亡，12株导致3只小鼠死亡，平均致死率为69.36%。引起至少2只小鼠死亡的28株菌中，有24株引起小鼠死亡的时间不超过18h。从死亡小鼠的肺脏、肝脏等器官中也分离到了同种菌。对照组无死亡。

3.3 耐药性检测 37株大肠杆菌的药敏试验结果见表1。结果表明，分离株对四环素、阿莫西林、复方新诺明、氨苄西林、庆大霉素、强力霉素有严重耐药性，耐药率高于80%，四环素的耐药率甚至达到了100%；对阿米卡星具有较高的敏感性，耐药率为13.5%。37株大肠杆菌全部表现为多重耐药，至少耐6种及以上受试药物，存在20种不同的耐药谱。表明四川地区猪源大肠杆菌致病菌株的耐药性强、耐药谱广。

表1 大肠杆菌分离株的耐药性检测

4 讨论

4.1 药敏试验结果显示37株耐药大肠杆菌对阿米卡星的敏感性较高，与2017年孔令汉等[4]、2015年王斌等[5]报道的结果一致，可能与该药尚未允许在兽医临床使用有关。值得关注的是，分离菌株中仍有13.5%对阿米卡星耐药，其耐药机制值得进一步探究。

4.2 β-内酰胺类抗生素不仅是兽医临床重要的抗生素，也是人医临床常用的抗生素品种，监测动物源细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性不仅对畜牧业健康发展有着重要意义，而且对人医临床也有着重要参考价值。本次试验分离的37株猪源大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林的耐药性高达90%以上，与曾博等[6]、王斌等[5]研究的结果相似。特别值得关注的是，近年来复方β-内酰胺酶抑制剂类抗生素和头孢类抗生素的耐药性在显著增加，可能与这两类药物在临床上的大量使用有关，建议养殖户在使用抗生素治疗猪病时，先筛选出有效药物再治疗，以避免抗生素滥用。