调节性T细胞在不同分期卵巢癌患者中的临床意义

戴 然 桑秀丽

卵巢癌致死率占妇科恶性肿瘤的首位，严重威胁女性生命健康。随着免疫学的迅速发展，关于卵巢癌细胞免疫的研究，引起了学者的广泛关注。有研究表明，卵巢癌的发生以及发展，除了与癌细胞的侵袭和恶性增殖有关外，与患者自身免疫调节功能的失衡也密切相关[1]，而淋巴细胞亚群的变化在这一过程中起重要作用。调节性T细胞(Treg)是一类T细胞亚群，具有阻止自身炎症疾病以及免疫病发生、调控免疫应答等作用，是近年来研究的热点[2-4]。Tregs主要指CD4+CD25+Treg[5]。大量研究显示，多数肿瘤患者中，Treg表达水平会异常升高，患者抗肿瘤免疫功能低下，而下调CD4+CD25+Treg活性或清除，其抗肿瘤活性可显著的增加，表明CD4+CD25+Treg的高表达抑制了患者自身抗肿瘤作用[6-8]。本研究检测卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg水平，研究其与疾病发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院2012年1月至2016年12月收治的卵巢癌患者58例，年龄21～72岁，平均(55.2±12.1)岁；根据国际妇产科联合会(FIGO)分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期6例，Ⅲ期31例，Ⅳ期16例；病理类型：黏液性癌11例，浆液性癌32例，卵巢交界性囊腺癌、腺瘤和混合癌总共15例。选取卵巢良性患者30例，年龄25～72岁，平均(53.1±10.2)岁；无免疫性疾病的健康女性35例，年龄22～71岁，平均(51.2±11.3)岁。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器 Calibur流式细胞分析仪(美国Becton Dickinson)；ZD-85恒温振荡器(中国常熟国华企业)；KDC-1042低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；加样器(量程分别为20 μl，50 μl，100 μl等)(法国GILSON)；TECAN酶标仪(奥地利)。

1.2.2 主要试剂 鼠抗人抗体：FITC-anti-CD4，PE-anti-CD8，PE-anti-CD25， 同型对照抗体均购自美国BD公司。红细胞裂解液。肿瘤相关抗原CA125酶免试剂(瑞典CanAg诊断试剂公司)。

1.2.3 收集标本 要求所有卵巢癌患者及健康者清晨空腹，采集其静脉血3 ml，立即以EDTA-K2抗凝，两者混匀。将单据号等患者信息贴在试管外壁上。

1.2.4 实验步骤 于每试管中加入100 μl的抗凝血，之后各加入相应抗体10 μl，振荡使之充分混匀，室温避光孵育20 min，加入500 μl的裂解液，裂解红细胞，振荡使之充分混匀，暗处孵育10 min。洗涤，1 200 r/min，离心5 min，弃去上清液；加入1 ml PBS，1 200 r/min，离心5 min，弃去上清液。加入300 μl PBS混匀，待流式细胞仪检测。

1.3 观察指标

应用流式细胞分析仪检测CD4+CD25+Treg在CD4+T细胞中所占百分比，CD4+CD25+Treg占全体T细胞百分比，CD4+在CD8+T细胞中所占百分比。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 健康女性、卵巢良性患者、卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值对比

卵巢癌患者CD4+CD25+Treg/CD4+T 细胞的比值明显高于健康女性和卵巢良性患者，差异均具有统计学意义(P<0.05)，卵巢良性患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T 细胞的比值与健康女性相比，差异无统计学意义(P>0.05)。健康女性、卵巢良性患者与卵巢癌患者外周血中CD4+/CD8+相比，差异均无统计学意义，P>0.05。见表1。

2.2 检测FIGO分期里CD4+CD25+Treg/全体T细胞比值

卵巢癌患者外周血里CD4+CD25+Treg/全体T细胞分别为Ⅰ～Ⅱ期(17.96±4.32)、Ⅲ期(20.02±6.21)、Ⅳ期(28.73±4.21)，与国际FIGO分期呈正相关关系，分期越晚，CD4+CD25+Treg与全体T细胞的比值越高； Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ期相比，差异无统计学意义(P>0.05)，Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期患者与Ⅳ期相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表1 健康女性、卵巢良性患者、卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+，CD4+/CD8+的比较

*为与健康女性组比，P<0.05;#为与卵巢良性患者组比，P<0.05。

3 讨论

Sakaguchi等在1995年发现CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)，其对机体免疫反应有着重要调控功能[9]。在生理和病理状态下，CD4+CD25+Treg对调控机体免疫应答、维持机体免疫自稳等起着重要作用[10]。尤其在病理状态下，许多肿瘤抗原为自身抗原，CD4+CD25+Treg增加，在维持对自身成分耐受的同时，阻止了机体对肿瘤细胞的免疫应答，导致肿瘤免疫逃逸，促进了肿瘤生长[11-13]。1999 年，Onizuka通过实验已证实，CD4+CD25+Treg抑制了针对肿瘤的免疫应答[14]。Wolf等发现，在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤患者肿瘤局部和外周血里，CD4+CD25+Treg的比例升高，数量同患者预后及肿瘤进展程度相关[15]。

通过流式细胞分析仪，本研究检测了健康女性、卵巢良性患者、卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg的分布情况，结果表明，卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞的比例明显高于卵巢良性患者及健康女性，表明卵巢癌患者外周血中Treg的功能增强。卵巢癌患者外周血中CD4+/CD8+T细胞比例与健康女性，卵巢良性患者相比，P>0.05，差异均无统计学意义。由此推测，CD4+CD25+Treg诱导的肿瘤免疫逃逸，主要在病灶局部的微环境中发生。同时，卵巢癌患者外周血中CD4+/CD8+T细胞比例低于健康女性，卵巢良性患者，表明Treg抑制CD4+等淋巴细胞的增殖、活化，限制了机体抗肿瘤免疫功能。在国际FIGO分期中，Ⅳ期卵巢癌患者外周血里CD4+CD25+Treg比例明显高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。晚期卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg数量会增加，出现这种现象，可能是调节性T细胞对肿瘤抗原刺激产生的生理性增殖或肿瘤诱导的调节性T细胞增殖。其发生的机制可能是：肿瘤细胞较少，其免疫源性足以刺激免疫应答，机体免疫监视功能可以有效地清除肿瘤细胞，相应CD4+CD25+Treg存在，肿瘤免疫应答维持在一个适度水平；当肿瘤细胞免疫源性接近正常组织或较弱，CD4+CD25+Treg发挥类似于维持自身耐受作用，保护肿瘤细胞。

综上所述， CD4+CD25+Treg细胞格局的改变对卵巢癌的发生、发展以及分期，起着重要作用，是卵巢癌疗效监测的重要指标。CD4+CD25+Treg比例升高，增殖时，会抑制机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，从而导致肿瘤的免疫逃逸，促使肿瘤进行性生长。在卵巢癌患者的治疗中，恰当地清除或者下调CD4+CD25+Treg，使之维持活化效应T细胞，有利于提高患者机体抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长，减轻肿瘤负荷。