黄芩苷对大鼠放射性肺损伤的保护作用

何志坚 胜海峰 刘海云

随着人们生活水平的提高，恶性肿瘤的发病率也越来越高，其中胸部恶性肿瘤发病率排名居首。除了手术，放射治疗是胸部恶性肿瘤的重要治疗手段之一。但在放疗过程中不可避免的会造成肺部损伤，所以放射性肺损伤是胸部放疗最常见的并发症，给患者的生活质量带来了严重影响，同时还限制了临床医生对肿瘤放射剂量的使用，影响疾病的疗效[1-2]。目前临床上放射性肺损伤的治疗多以激素治疗为主，但用药时间长，副作用多且效果欠佳，因此寻求1种有效且副作用少的理想药物是当今放射性肺损伤的研究热点之一[3]。国内外大量研究证明，中医药治疗对放射性肺损伤有比较好的疗效及较低的毒副作用。因此本实验研究通过建立放射性肺损伤大鼠模型，观察中药黄芩苷对放射性肺损伤大鼠血浆TNF-α、TGF-β1，IL-1含量的影响，研究黄芩苷防治放射性肺损伤的效果并探讨其可能的作用机理，进一步为临床的治疗提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠144只，体重(200±20)g，大鼠由江西中医药大学实验动物中心提供，雄性，许可证号SYXK(赣)2017-0023。室温20 ℃～22 ℃，相对湿度40%～67%，空气新鲜，通风良好，大鼠分笼固体饲料喂养，自由饮水，正式开始实验前适当饲养4天左右，无异常者纳入分组实验。

1.2 试剂

黄芩苷(上海源叶生物科技有限公司，批号：C22J7Y9309)；地塞米松(河北天成药业股份有限公司，批号：H13021677，规格：5 mg/支)；脂多糖(LPS)(北京索莱宝科技有限公司，规格：10 mg/瓶，批号：1020K032)；白细胞介素1(IL-1)、转化生长因子β1(TGF-β1)肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒均购于武汉博士得生物工程有限公司，编号分别为 EK0745，EK0527，EK0465；其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器

微量进样器(德国eppendorf公司)，数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，AdventurerTM电子天平(奥豪斯国际贸易有限公司)，TGL-16G型台式高速离心机(上海市实验仪器总厂)，TECAN酶标仪sunrise(奥地利TECAN公司) EL3Olsrip Reader 酶标仪(均为美国Bio Tek 公司) ，显微镜(Motic麦克奥迪实业集团有限公司)，6MV-X 线直线加速器(山东新华医疗器械有限公司)；550 型酶标仪(美国Bio-Rad 公司)。

1.4 药物浓度配制

根据《中药药理研究方法学》记载方法计算实验动物用药量，根据成人的临床用量，按大鼠的等效剂量折算系数，换算为大鼠给药量，地塞米松大鼠用药剂量为5 mg·kg-1，黄芩苷用药剂量分别为50、100、200 mg·kg-1。用无菌生理盐水(0.9%氯化钠注射液)溶解，搅拌均匀，每次实验前现配，每天1次，连续7天。

1.5 分组及给药

144只雄性SD大鼠随机分成6组，正常对照组、模型组(单纯照射组)、激素(地塞米松)组、中药黄芩苷低、中、高剂量(50、100、200 mg·kg-1)组，每组24只，除正常对照组，其余各组均要进行X线照射，照射前3天至照射后第28天对大鼠行腹腔注射处理，其中黄芩苷和地塞米松用无菌生理盐水混匀，按5 mL·kg-1给药体积进行腹腔注射，正常对照组及单纯照射模型组注射相同体积的生理盐水。第4周以后所有组均给相同体积的生理盐水直至取材。每组分别在第2、4、8、12周各处死6只大鼠，取标本备用。

1.6 动物造模[4]

造模大鼠选用10%的水合氯醛，按3 mL/kg腹腔注射麻醉，按一定顺序仰卧于照射台上，调整好照射视野，上至大鼠前肢两腋窝中点连线，下至剑突水平，照射面积为4.5 cm×4 cm。除正常组假装照射外，其他各组都用直线加速器6MV-X线进行全肺单次照射(照距SSD为100 cm)，剂量300 cGy/min，总剂量为20 Gy，照射前紫外线照射消毒。

1.7 标本留取

各组大鼠分别于首次照射结束后第2、4、8、12周末次给药后禁食6 h，随机抽取6只大鼠，称重，根据体重用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉; 随后将大鼠固定，仰卧位，手术刀切开皮肤打开胸腔并暴露其心脏，随即进行心脏取血5 ml，把血分装在离心管中，室温静置1 h，离心机离心(转速3 000 r/min)10 min后，微量加样器吸取上清液，分装入EP管中置于-80 ℃冰箱冻存，备用。取血完毕后，迅速摘取右肺组织，置于10%甲醛溶液固定，备用。

1.8 血清指标检测

取备用血清采用双抗体夹心酶联免疫(ELISA)法，检测TNF-α、IL-1、TGF-β1因子浓度，具体操作方法按照试剂盒里详细的说明进行。

1.9 统计处理

2 结果

2.1 一般情况的观察

正常对照组大鼠精神状态好，活泼爱动，饮食正常，皮毛光泽；模型组(单纯照射组)大鼠精神萎靡，活动减弱，进食减少，皮毛颜色变暗无光泽，活动则喘。黄芩苷和地塞米松给药组精神和活动度尚可，饮食由开始差逐渐好转，均无大鼠死亡现象。

2.2 各组大鼠各时点血清TNF-a含量的变化

与正常对照组比较，各时间点模型组大鼠血清TNF-a含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，第4周和第8周达到高峰，第12周开始下降。与模型组比较，黄芩苷中、高剂量给药组和地塞米松治疗组大鼠血清TNF-a含量均显著降低，差异有统计学意义，见表1。

表1 各组大鼠各时点血清TNF-a含量的变化

注：与正常对照组比较，①为P<0.05；与衰老模型组相比，②为P<0.05。

2.3 各组大鼠各时点血清TGF-β1含量的变化

与正常对照组比较，各时间点模型组大鼠血清TGF-β1含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，第4周和第8周达到高峰，第12周开始下降。与模型组比较，黄芩苷中高剂量给药组和地塞米松治疗组大鼠血清TGF-β1含量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠各时点血清TGF-β1含量

注：与正常对照组比较，①为P<0.05；与衰老模型组相比，②为P<0.05。

2.4 各组大鼠各时点血清IL-1含量的变化

与正常对照组比较，各时间点模型组大鼠血清IL-1含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，第4周和第8周达到高峰，第12周开始下降。与模型组比较，黄芩苷中、高剂量给药组和地塞米松治疗组大鼠血清IL-1含量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠各时点血清 IL-1含量

注：与正常对照组比较，①为P<0.05；与衰老模型组相比，②为P<0.05。

3 讨论

黄芩是唇形科草本植物(Scutellaria baicalensis Georigi)的干燥根，黄芩主要生长在我国的北方，如河北、河南、山东、内蒙古、陕西、东北等地；在韩国，日本也有发现。黄芩苷是黄芩中的有效成分之一，是一种黄酮类化合物，具有多种药理作用，如抗菌、消炎、降压、保肝、利胆等多种作用[5]。常用于治疗一些感染性疾病。研究发现黄芩水提物对脂多糖造成的急性肺损伤有一定的保护作用[6]。本实验是研究黄芩苷对放射性肺损伤的防治研究。

胸部肿瘤在放疗的过程中，很容易发生放射性肺损伤，其最常见的两种形式是放射性肺炎与放射性肺纤维化。放射性肺炎一般发生在第1～3个月，继而再发生肺纤维化。如果患者一旦发生肺纤维化就是不可逆转的，治疗效果就会比较差[7]。因此，在对患者进行放疗的同时，还应使用药物进行干预治疗，以降低放射性肺损伤的发生。放射性肺损伤的发病机理还未完全清楚，其中细胞因子学说是造成放射性肺损伤的主要假说之一。放射性肺损伤的早期表现为肺泡内大量炎症细胞的浸润，随后引起大量炎性介质和细胞因子的释放[8]，如TGF-β1、IL-6、TNF-α等细胞因子在放射性肺损伤的发生发展中起到重要作用。

TNF-α与早期放射性肺损伤关系密切，有非常强的局部促炎性反应作用，和白细胞介素IL-1等被统称为前炎症细胞因子，主要通过改变血管内皮细胞的通透性，刺激中性粒细胞和淋巴细胞的渗出，是启动炎症反应的关键细胞因子。本实验结果表明与正常对照组比较，各时间点模型组大鼠血清TNF-a含量显著升高，第4周和第8周达到高峰，第12周开始下降。说明血清中TNF-a对早期放射性肺损伤比较敏感，与模型组比较，黄芩苷中高剂量给药组和地塞米松治疗组大鼠血清TNF-a含量均显著降低。说明黄芩苷可以降低血清中TNF-a的含量，对放射性肺损伤有一定的防治作用。

TGF-β1是放射性肺损伤比较公认的的预测因子[9]，是一种多功能的重要前炎性因子，可以增加中性粒细胞分泌多种炎性细胞因子，进一步扩大其生物效应，加速肺损伤的发生发展，TGF-β1含量升高被认为是放射性肺损伤的标志之一。本实验结果表明黄芩苷可以降低血清中TGF-β1的含量，对放射性肺损伤起到一定的保护作用。

总之，本实验通过建立大鼠放射性肺损伤实验模型，观察了中药黄芩苷在各个时间点对大鼠放射性肺损伤的防治作用，研究结果表明放射性肺损伤模型组促炎性因子TGF-β1、IL-6和TNF-α明显升高，而中药黄芩苷干预后明显降低了血清中TGF-β1、IL-6和TNF-α的含量，证明中药黄芩苷对促炎性因子具有一定的抑制作用，对放射性肺损伤具有一定的保护作用，在一定程度上能减轻了肺损伤。