疲劳模型大鼠T1/T2平衡变化及其与IL-12、IL-27的关系研究

吴丽珺

(河南财政金融学院 体育系，河南 郑州 450046)

0 引言

疲劳是指“机体的生理过程不能持续其机能在一特定水平或不能维持预定的运动强度”[1].疲劳有多种表现形式，其中力竭是疲劳的一种特殊表现形式，机体在疲劳状态下继续从事运动，直到肌肉或器官不能维持运动，即为力竭状态.自哈佛大学疲劳研究所开始重视疲劳问题的相关研究以来，疲劳的发生机制就一直是科学界研究的热点问题.一百多年以来，学者们从不同的角度对疲劳机制进行了研究.包括衰竭学说、堵塞学说、内环境稳定失调学说、保护性抑制学说、突变理论与自由基损伤学说等理论[1]的出现，丰富了疲劳发生机制的研究体系，但仍难以解释疲劳发生过程中的一些问题，如免疫机能的改变.因此，基于“J形曲线理论”[2]、“开窗理论”[3]、“免疫抑制因子调节学说”[4]等研究成果的基础上，有学者将“神经-内分泌-免疫调节网络”理论[5]引入到疲劳学说的研究当中.

随着研究的进一步深入，研究者们发现，免疫机能如细胞免疫或体液免疫水平的降低并不是身体机能下降的主要因素，而免疫平衡的改变如1型T细胞(T cell-1, T1)/2型T细胞(T cell-2, T2)失衡才是抑制身体机能的主要诱因.T1/T2平衡主要用于判断机体细胞免疫与体液免疫之间的平衡状态，T1、T2型细胞因子分泌的改变是T1/T2平衡常用的评价依据.γ-干扰素(Interferon-γ, IFN-γ)、白细胞介素-4(Interleukin-4, IL-4)是T1、T2细胞分泌的最典型的细胞因子[6, 7]，两者分泌水平的变化都会导致T1/T2失衡，从而影响身体机能.然而，在疲劳发生过程中，导致T1/T2失衡的机制目前还不清楚.研究发现，抗原提呈细胞(Antigen presenting cell, APC)所产生的白细胞介素-12(Interleukin-12, IL-12)、白细胞介素-27(Interleukin-27, IL-27)是介导IFN-γ分泌、启动T1型免疫反应的关键细胞因子[8-11].那么，疲劳发生过程中T1/T2平衡的变化是否与IL-12、IL-27分泌的改变有关，仍需实验进行证实.因此，本研究拟采用力竭游泳运动训练的方式建立大鼠疲劳模型，通过观察疲劳大鼠T1/T2平衡的变化及其与IL-12、IL-27的关系，探讨疲劳大鼠T1/T2失衡的可能机制.

1 实验材料与方法

1.1 实验动物及分组

20只清洁级SD大鼠，体质量341±27 g，8周龄.饲养按照要求进行，饲养环境温度18 ℃～25 ℃，相对湿度40%～60%，自然光照，自由饮食和饮水.大鼠适应喂养1周后进行分组，随机分成正常对照组(A组，n=10)与疲劳模型组(B组，n=10)两组，分组后两组大鼠体质量无显著差异.

1.2 疲劳模型的建立

借助力竭游泳运动训练的方式，采用文献[12]的大鼠游泳力竭标准(大鼠协调动作消失，水淹没鼻尖，身体下沉，至再次浮出水面时长超过10 s，连续3次且放于游泳池外平台无法完成翻正反射)建立大鼠疲劳模型.对B组大鼠采用力竭游泳运动训练的方式建立疲劳模型，A组大鼠不进行任何针对性活动安排.为使大鼠能够适应游泳，先让其学习游泳3 d，第1 d游泳10 min，第2 d游泳15 min，第3 d游泳20 min，然后进行5周的力竭游泳运动训练.具体训练方案见表1.

表1 大鼠力竭游泳训练方案Tab. 1 Exhaustive swimming training program in rats

大鼠游泳时间采用每天逐渐增加的方式，时间增加的幅度依据大鼠每天游泳训练后的疲劳状态和第2 d的活动情况来安排.负重采用小重量的螺丝帽，由钥匙环串成，根据大鼠每日体质量的百分比通过增减螺丝帽的数量来控制负重大小.负重由小皮筋连接绑在大鼠上肢的腋下部位.游泳训练过程中重点观察大鼠动作的协调程度，当大鼠动作出现明显不协调、沉入水底后不能保持站立姿势时，迅速捞起并用干毛巾擦干让其休息5 min左右，之后再放入游泳池中[13].游泳训练期间，详细观察和记录大鼠的运动能力、疲劳状态与活动情况.游泳池水深为50 cm，水温29 ℃±1 ℃.

1.3 测试样本的采集、处理与测试

在完成最后一次力竭游泳后24 h，采集B组大鼠股动脉血2 mL.A组大鼠同时间段取血，采集股动脉血2 mL.血液样本采用3000 r/min离心5 min，收集上清液为血清，采用双抗体夹心亲和素-生物素复合-酶联免疫吸附测定法(ABC-ELISA法)测试血清中IFN-γ、IL-4、IL-12、IL-27含量，测试方法严格按照试剂盒说明书进行.

1.4 数理统计

2 实验结果

2.1 B组大鼠游泳训练及活动情况

在力竭游泳运动训练的第5周，B组大鼠溺水死亡2只，其余均完成运动训练安排，因此B组实际纳入本研究数据结果统计的样本为8个.游泳训练第1、2周，每天训练结束后大鼠活动逐渐减少，但在第2 d仍能恢复至训练前的精神状态.第3、4、5周随着训练时间和负重的增加，每天训练结束后大鼠活动呈现明显的疲劳状态，出现肌力明显减弱、躯干代替四肢支撑身体休息、在外力的驱赶下仍不活动等现象，且在第2 d疲劳状态仍未恢复，饲养笼内的活动明显减少.

2.2 疲劳大鼠血清IFN-γ、IL-4含量变化

采用ABC-ELISA法对大鼠血清IFN-γ、IL-4含量进行测试，并计算IFN-γ/IL-4比值，见表2.

表2 两组大鼠IFN-γ、IL-4含量的比较Tab. 2 Comparison of IFN-γ、IL-4 between the two groups of rats

注：“★”表示与A组相比，P<0.05.

比较两组结果发现：B组大鼠血清IFN-γ含量(159.02±39.08 ng/L)低于A组(205.88±34.24 ng/L)，且存在显著性差异(P=0.015)；B组大鼠血清IL-4含量(56.61±15.97 ng/L)高于A组(54.17±17.89 ng/L)，统计分析未呈现显著性差异(P=0.767)；B组大鼠血清IFN-γ/IL-4比值(2.92±0.69)低于A组(4.12±1.35)，存在显著性差异(P=0.037).

2.3 疲劳大鼠血清IL-12、IL-27含量的变化

采用ABC-ELISA法对大鼠血清IL-12、IL-27含量进行测试，见表3.由表3可见，B组大鼠血清IL-12含量(42.20±13.41 ng/L)低于A组(57.60±15.86 ng/L)，且存在显著性差异(P=0.044)；B组大鼠血清IL-27含量(17.70±6.06 ng/L)也低于A组(22.56±5.12 ng/L)，但未达到显著性差异水平(P=0.084).

表3 两组大鼠IL-12、IL-27含量的比较Tab. 3 Comparison of IL-12、IL-27 between the two groups of rats

2.4 大鼠血清IL-12、IL-27与IFN-γ的相关性

从Pearson相关性检验结果来看，大鼠血清IL-12与IFN-γ的含量显著相关(r=0.704，P<0.01)，但血清IL-27与IFN-γ的含量无显著相关(r=0.212，P>0.05)，血清IL-12与IL-27的含量也无显著相关(r=0.074，P>0.05).

3 分析与讨论

3.1 疲劳模型大鼠T1/T2平衡的变化

在免疫平衡中，T1/T2平衡主要用于反映细胞免疫与体液免疫之间的平衡状态.IFN-γ等细胞因子分泌相对增多或IL-4等细胞因子分泌相对减少，表明细胞免疫反应增强，T1/T2平衡向T1方向偏移；反之，IL-4等细胞因子分泌相对增多或IFN-γ等细胞因子分泌相对减少，表明体液免疫反应增强，T1/T2平衡则向T2方向偏移.相比之下，IFN-γ/IL-4比值的变化更能直观地反映T1/T2平衡的变化，该比值的增大和减小可直接反映细胞免疫与体液免疫之间的平衡变化.基础研究认为，机体的免疫机能需要在整体水平上保持动态平衡，在获得性免疫阶段，细胞免疫与体液免疫之间需保持动态平衡，不然将会导致疾病、造成病理损伤或加重病情[14].其中，未达到疾病的疲劳状态也可能与细胞免疫和体液免疫的失衡有关.为避免末次游泳训练所引起的应激反应对实验结果造成影响，本研究将取材时间定为末次游泳训练后24 h.本研究结果发现，疲劳模型大鼠血清IFN-γ含量显著降低(P<0.05)，但血清IL-4含量未发生明显变化(P>0.05).此外，疲劳模型大鼠血清IFN-γ/IL-4比值也显著降低(P<0.05).以上研究结果表明，疲劳模型大鼠会出现T1/T2失衡，表现为T1型免疫反应抑制，细胞免疫功能下降，而T1/T2失衡可能是导致大鼠疲劳的重要诱因.同类研究中，苏利强等研究发现，10 d递增负荷游泳至力竭后8 h，外周血血清IFN-γ水平与血清IFN-γ/IL-4比值均显著下降[15]；5周递增负荷游泳至力竭后24 h，外周血血清IFN-γ水平与血清IFN-γ/IL-4比值也均显著下降(P<0.05)[12].另一项研究中，4周递增负荷游泳训练可引起大鼠血浆IFN-γ含量显著降低(P<0.01)，血浆IFN-γ/IL-4比值也显著降低(P<0.05)[16].以上研究与本研究结果呈现一致的变化趋势.

3.2 疲劳模型大鼠IL-12、IL-27的变化及其与T1/T2平衡的关系

T1细胞的分化与IFN-γ的产生与细胞因子IL-12、IL-27的作用有关,IL-12是T1细胞分化的启动细胞因子[8].研究发现，用抗IL-12的血清耗尽IL-12或者基因敲除IL-12时，会抑制细胞因子IFN-γ的分泌[17].IL-12是由APC分泌、由p35与p40两条多肽链通过二硫键共价结合形成的异二聚体(p70)[18]，通过与同样由2条型的受体(IL-12R1、IL-12R2)形成[19]的IL-12R结合，启动胞内的Janus激酶(Janus kinase, JAK)/信号传导与转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription, STAT)信号通路的转导与IFN-γ mRNA等的转录[20].IL-27同属IL-12家族成员，也主要由APC分泌.与IL-12结构类似，IL-27也是由两条多肽链通过二硫键组成，分别为p28(IL-12 p35的相关多肽)和EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus induced gene 3, EBI3)，通过启动胞内不同JAK/ STAT信号通路的转导来促进IFN-γ 的分泌[21].此外，IL-12与IL-27在促进T1细胞分化与IFN-γ产生的过程中还具有协同作用.

目前，疲劳机体T1/T2平衡与IL-12的关系已有相关研究进行探讨[16, 22-24]，但与IL-27的关系尚未见相关研究报道.美国学者以1-型单纯疱疹病毒感染小鼠为实验对象研究发现，在递增负荷运动至力竭并感染病毒2 d后，小鼠脾细胞分泌的IL-12与IFN-γ均显著降低[23].日本学者以运动员为实验对象研究发现，力竭运动后运动员血浆IFN-γ活性下降，而血浆IL-12p40(IL-12的拮抗剂)却显著升高[24].我国学者研究发现，4周递增负荷游泳训练不仅可引起大鼠血浆IFN-γ含量显著降低(P<0.01)、血浆IFN-γ/IL-4比值显著降低(P<0.05)，还可引起大鼠血浆IL-12含量显著降低(P<0.01)，且大鼠血浆IL-12与IFN-γ的含量呈显著正相关关系(P<0.01)[16].本研究结果发现，疲劳模型大鼠血清IFN-γ含量与IL-12含量均显著低于正常对照组(P<0.05)，但血清IL-27含量与正常对照组相比无显著性差异.此外，大鼠血清IL-12与IFN-γ的含量呈显著正相关(P<0.01)，但血清IL-27与IFN-γ含量、IL-12与IL-27含量之间均无显著相关关系(P>0.05).

4 结论

经过5周力竭游泳运动训练，疲劳大鼠出现T1/T2失衡，表现为T1型免疫反应抑制，细胞免疫功能下降，而T1/T2失衡是导致大鼠疲劳的重要诱因.疲劳大鼠T1/T2平衡的变化与IL-12分泌的变化有关，但与IL-27分泌的关系并不密切.

本研究中:(1)疲劳模型组大鼠负重游泳运动强度较大，导致2只大鼠在力竭游泳过程中溺水死亡，最后实际纳入本研究数据结果统计的样本仅为8个.未来的相关实验研究应注意观察大鼠游泳过程中动作的协调程度，预判大鼠的疲劳状态并及时做好救护准备.(2)受研究经费等的限制，本研究仅观察了末次训练后24 h一个时相，研究结果虽能揭示疲劳大鼠T1/T2平衡的变化，但无法深入了解在大鼠疲劳发生发展过程中T1/T2平衡的变化和作用，建议未来的相关实验研究增加如末次训练后8、24、72 h等时相的观察.