抑制糖原合酶激酶活性对老龄大鼠内皮祖细胞增殖的作用机制*

崔斌 刘曦 秦浙学 陈剑飞 李佳蓓 于世勇 黄岚

(第三军医大学新桥医院全军心血管内科研究所，重庆400037)

血管内皮损伤是血管性疾病的始动环节，加速血管内膜修复进程是损伤性血管疾病防治的关键。自兼具干细胞及内皮细胞特性的内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)发现以来，其在血管内膜修复中的作用受到广泛关注[1-3]。而高龄冠心病患者循环中的EPC数量减少、功能不良，成为EPC自体移植在血管损伤性疾病临床应用的瓶颈[4-6]。因此，明确老龄EPC增殖分化的调控机制具有重要意义。因参与细胞内糖代谢过程的重要物质糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在干细胞的增殖、分化和凋亡等多种重要生理过程中发挥重要作用[7-10]，我们推测GSK-3β可能在兼具干细胞特性EPC的增殖功能上发挥调节作用。本研究旨在观察基因转染抑制GSK-3β活性在老龄EPC增殖中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 选取清洁级老龄雄性Wster大鼠10只(鼠龄18周，体重500～550g)，由第三军医大学实验动物中心提供并进行标准喂养，所有操作均符合相关伦理学规定。将大鼠分为基因转染组及对照组，每组各5只。基因转染组为转染表达催化GSK3β失活的GSK3β-KM基因的重组缺陷型腺病毒(pMSCV-GSK3β-KM)以抑制EPC的GSK3β活性，对照组为转染表达携带绿色荧光蛋白的空病毒载体pMSCV-GFP。主要试剂包括：大鼠淋巴细胞分离液购于天津灏洋生物公司；优质胎牛血清、DMEM培养液购自Hyclone公司；DiI-乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)购自Molecular probe公司；人纤维连接蛋白、二苯基四氮唑溴盐(MTT)、胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)及FITC标记荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)购自Sigma公司；VEGF 购自Pepro Tech公司；pGSK-3β、β-catenin 、cyclinD1及GAPDH兔抗大鼠抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG购自武汉博士德公司。细胞株293、含催化GSK3β失活的GSK3β-KM基因的重组逆转录病毒质粒pMSCV-GSK3β-KM由全军心血管病研究所提供。脂质体lipofetamine2000购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 EPC的分离、培养与鉴定 采用Ficoll密度梯度离心法分离老龄雄性Wister大鼠骨髓源性单个核细胞，接种于包被纤连蛋白的培养瓶中，置于含20%胎牛血清、50ng/ml VEGF的DMEM培养液中，37℃、5%CO2条件下培养，3～4天更换培养液。采用AcLDL摄取法及FITC-UEA-I细胞免疫荧光法对EPC进行鉴定，荧光显微镜下DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I染色双阳性细胞为正在分化的EPC[11]。

1.2.2 重组逆转录病毒的制备 将携带GSK3β-KM基因的pMSCV-GSK3β-KM或空病毒载体pMSCV-GFP采用脂质体lipofectamine2000介导法转染至293细胞培养6小时。更换培养液后继续培养72小时。收集病毒上清液，离心、沉淀、过滤后-70℃保存备用[12]。

1.2.3 基因转染 取对数生长期的EPC分别加入表达催化GSK3β失活的GSK3β-KM基因pMSCV-GSK3β-KM或空病毒pMSCV-GFP的病毒上清液，再加入终浓度8mg/L的聚凝胶和无血清、无抗生素的DMEM。6小时后弃去转染液，加入等量DMEM培养72h。荧光显微镜下观察转染后EPCs的荧光表达情况。

1.2.4 EPC增殖能力检测 镜下计数法：荧光倒置显微镜下对每组DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I染色双阳性的EPC进行计数(计数5个随机选择的×200倍视野的EPC)。MTT检测法：0.25%胰蛋白酶消化收集EPC，500μl培养液重悬细胞计数。将等量EPC接种到96孔培养板中培养48小时，加入MTT 6h后弃上清，加入二甲基亚砜终止反应，放置于微量振荡器上充分震荡10min，于酶联免疫检测仪490 nm 波长处检测吸光度值。

1.2.5 EPC细胞周期检测 离心收集各组EPC，PBS洗涤2次，70%预冷乙醇固定，4℃过夜。PBS洗涤后EPC重悬于50μl/ml的碘化丙啶染液中,37℃避光孵育30min。流式细胞仪于488nm激发波长下进行荧光分选，测定分析细胞DNA含量分布，计算G0/G1期、S期及G2/M期细胞比例。每组实验重复3次。

1.2.6 蛋白印迹法检测蛋白表达 用蛋白裂解液分别提取各组EPC蛋白，测定蛋白总浓度。电泳分离、电转膜、封闭后分别加入兔抗大鼠pGSK3β(1：1000)、β-catenin(1：1000)、cyclinD1(1：500)及GAPDH(1：1000)抗体，4℃过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1：1000)孵育2小时。化学发光法显影，凝胶成像分析仪行灰度扫描半定量分析蛋白表达量。

2 结果

2.1 EPC培养及鉴定 密度梯度法分离获取的单个核细胞呈圆形，透光性好，48 小时后开始贴壁，逐渐生长呈梭形或纺锤形内皮样细胞。荧光显微镜下可见DiI-acLDL和FITC-UEA-I染色双阳性的细胞为正在分化的EPC，见图1。

2.2 抑制GSK3β活性对EPC数量及增殖能力的影响 利用基因转染方法将GSK3β-KM基因转染至EPC，观察抑制GSK3β活性对EPCs数量及增殖能力的影响。与对照组比较，基因转染组EPC数量显著增加(35.8±1.48 vs. 59.4±2.41,P<0.01)，见图2A。基因转染组EPC在490nm吸光度值与对照组比较差异性显著(0.273±0.010 vs. 0.669±0.0776，P<0.01)，见图2B。

2.3 抑制GSK3β活性对EPC细胞周期的影响 荧光激活细胞分离仪分析显示基因转染组EPC细胞周期中S期比例较对照组明显增加,两组之间差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

图1EPC培养及鉴定

Figure1EPCcultureandidentification

注：A. EPC摄取DiI-acLDL表达红色荧光；B. EPC与FITC-UEA-I结合表达绿色荧光(×200)
图2抑制GSK3β活性增加EPC数量及增殖能力(n=5)

Figure2GSK3βinhibitonincreaseEPCnumberandproliferation

注：与对照组比较，①P<0.01

2.4 抑制GSK3β活性对EPC中Wnt下游信号通路的影响 为了明确抑制GSK-3β活性对EPC中Wnt下游信号通路的调节作用，我们采用蛋白印迹法测定pGSK3β、β-catenin及cyclinD1的蛋白表达。结果显示，与对照组比较基因转染组pGSK3β、β-catenin及cyclinD1的蛋白表达显著增加(P<0.01)，见图3。

表1 抑制GSK3β活性对EPC细胞周期的影响Table 1 The effect of GSK3β inhibition on EPC cell cycle

注：与对照组比较，①P<0.01

图3 抑制GSK3β活性上调pGSK-3β、β-catenin及cyclinD1的蛋白表达Figure 3 GSK3β inhibition up-regulate the expression of pGSK-3β、β-catenin and cyclinD1注：与对照组比较，①P<0.01

3 讨论

EPC从骨髓释放至外周循环过程中逐渐分化为内皮细胞，参与损伤内膜的修复过程。研究学者积极探索EPC在细胞移植的优势作用，认为EPC可能作为种子细胞参与血管损伤性疾病的临床治疗。而老年冠心病患者成体循环中EPC数量不足及功能受限，成为EPC自体移植临床应用的瓶颈。我们前期研究亦证实随着年龄的增加，大鼠EPCs的数量及增殖能力逐渐受损。因此，明确调控老龄EPC增殖的机制有益于EPC移植的临床应用。

GSK-3β是糖代谢通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，近来发现其不但参与糖代谢过程，而且在干细胞(胚胎干细胞、造血干细胞及神经干细胞等)的增殖、分化及凋亡过程中亦发挥重要作用。EPC兼具干细胞和内皮细胞特性，我们推测GSK-3β对EPC可能发挥相似的调控作用。结果发现基因转染组EPC的数量及增殖能力较对照组显著增加，可增强EPC移植在抑制血管内膜增生以及损伤血管再内皮化中的作用[13]。Hibbert B研究团队的系列研究中进一步发现抑制GSK-3β活性还可加速药物涂层支架所致的延迟再内皮化进程[17]。GSK-3β活性抑制在血管再内皮化中的加速作用可能缘于其显著的促EPC增殖能力。本研究表明抑制GSK-3β活性可促进老龄EPC从静止期向DNA合成期及有丝分裂期转化。抑制GSK-3β活性可对Wnt下游信号通路发挥作用，通过蛋白印迹法检测发现抑制GSK-3β活性可显著上调pGSK-3β、β-catenin及cyclinD1的蛋白表达。作为Wnt通路中传递信号的重要分子，β-catenin在细胞增殖中发挥核心调控作用。Wnt信号通路激活后细胞内GSK-3β的活性被抑制，减弱了对β-catenin的磷酸化作用。未磷酸化的β-catenin 在胞质中积累,并转运至胞核,继而同转录因子TCF/LEF结合形成异源二聚体,激活TCF/LEF活性，启动下游靶基因cyclinD1、c-myc等的转录和表达[18-20]。主要分布于细胞核中的CyclinD1是重要的细胞周期调控蛋白，参与细胞的增殖。我们研究发现抑制GSK-3β活性可通过激活Wnt/β-catenin信号通路, 上调β-catenin及CyclinD1的表达，促进EPC细胞周期S期比例增加，继而增强EPC的增殖能力。上述结果与我们前期采用氯化锂药物干预抑制GSK-3β活性对EPC增殖能力作用相似。因此推测，无论药物干预还是基因转染抑制GSK-3β活性均可促进EPC的增殖活性。

4 结论

利用基因转染抑制GSK-3β活性可激活Wnt/β-catenin信号通路、促进老龄大鼠EPC增殖，为有效扩增老年患者自体EPC治疗血管损伤性疾病的临床应用提供实验基础。