七叶树花挥发油的GC-MS方法优化及β-葡萄糖苷酶对七叶树花的增香作用

高玉琼，郭利影，孟宪鑫，张丽娜，杨广德

(西安交通大学药学院，陕西 西安 710061)

中华七叶树 (AesculuschinensisBunge)又名七叶树、婆罗树、娑罗树，属七叶树科七叶树属植物[1]，是一种良好的观赏树种，又具有很高的医疗保健价值。目前，已有报道[2]对七叶树种子的化学成分、药理作用等做了描述，认为其主要含有五环三萜皂苷类化合物及黄酮苷类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等方面的作用。近年来其种子中也分离出了6种新的三萜皂苷，且经过毒性试验认为其对MCF-7细胞具有活性抑制作用[3]。同时，尉芹[4]等对七叶树叶提取物进行了抗氧化性能研究，同时初步鉴定出其提取物中含有酚类及鞣质、有机酸、黄酮类化合物、植物甾醇等活性成分。刘宏伟[5]等从七叶树树叶中分离得到了4个化合物：原七叶树皂苷元、21-当归酰基-原七叶树皂苷元、21β-当归酰基-原七叶皂苷配基-3β-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)][β-D-吡喃葡萄糖基(1-4)]β-D-吡喃葡萄糖醛酸和异秦皮苷。刘军生[6]等还从七叶树的根和茎中分离出了一株具有高产七叶皂苷C的内生真菌EA-LIS80，而七叶树花挥发油的化学成分目前尚未报道。为进一步探讨其花的化学成分与其种子等的异同，采用了在挥发性成分测定中使用较为广泛的气相色谱-质谱联用法，参考文献方法[7]对七叶树花的挥发油进行了气相色谱-质谱分析。

β-葡萄糖苷酶是一种广泛存在于生物界的水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。不仅如此，β-葡萄糖苷酶还能将果蔬及茶叶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质[8-10]。本实验利用β-葡萄糖苷酶水解七叶树的鲜花、干花及干燥花苞，以验证β-葡萄糖苷酶对其是否具有增香作用。

1 实验材料及方法

1.1 材料、仪器与试剂

材料：新鲜七叶树花及花苞于2018年5月采自西安交通大学药学院的药园，由西安交通大学药学院牛晓峰教授鉴定为七叶树科植物七叶树(AesculuschinensisBunge)的花。

仪器：GCMS-TQ8040型气相色谱-质谱联用仪(日本岛津)；AY120电子天平(日本岛津)。

试剂：β-葡萄糖苷酶(上海源叶生物科技有限公司，100 u/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公，色谱纯)；无水硫酸钠(西安化学试剂厂，分析纯)；磷酸氢二钠(河南焦作市化工三厂，分析纯)；柠檬酸(成都化学试剂厂，分析纯)。

1.2 实验方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶水解反应。分别称取2份200g新鲜七叶树花(或干花或干燥花苞)于500mL pH 5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中，其中一份加0.2g β-葡萄糖苷酶，同时置于摇床中50℃恒温水浴5h。同法制备空白溶液。

1.2.2 挥发油的提取。200g β-葡萄糖苷酶水解前后的鲜花、干花及干燥花苞，分别进行水蒸气蒸馏，馏液用正己烷萃取，无水硫酸钠干燥后回收溶剂得挥发油约0.1g，得率为0.05%。挥发油为淡黄色透明油状液体。将提取得到的挥发油用正己烷溶解并定容至10mL。

1.2.3 气相色谱-质谱联用的色谱条件筛选。实验采用SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛细管色谱柱，载气为He，其它色谱条件进行比较筛选后确定。

1.2.3.1 升温程序：于10mL量瓶中取1mL七叶树花挥发油提取物进样，在色谱柱始温为80℃，保持2min后以10℃/min升温至110℃，再分别以5℃/min升温至260、270和280℃，保持2min的条件下进样分析，结果表明升温至280℃为宜。

最终确定升温程序为：柱始温80℃，保持2min，以10℃/min速率升到110℃，再以5℃/min升温至280℃，保持2min，可达到较好分离。

1.2.3.2 分流比：在确定升温程序后，分别设定分流比为40∶1，30∶1，20∶1，10∶1，5∶1和直接进样，进行分析，结果显示分流比的改变会影响出峰时间与峰强度，在对比峰形及峰强之后，确定分流比为5∶1。

1.2.3.3 流速：不同的载气流速会引起成分出峰时间的改变，故分别于流速为0.6、0.8、1.0 mL/min的条件下进样，结果显示当流速为0.8 mL/min时其色谱峰分离效果较好。

1.2.3.4 离子源电压：在6种不同的离子源电压30、40、50、60、70、80eV下进行分析，在70eV时峰强度最大峰形最好，故确定以70eV为宜。

1.2.3.5 离子源温度：分别于离子源温度为230、250℃的条件下进样分析，结果显示250℃时峰形较好，峰强较大，故确定以250℃为宜。

1.2.3.6 接口温度：在2种不同接口温度250、280℃下进行分析，结果显示主成分相对含量几乎无差别，同时参照仪器设置接口温度需比离子源温度高20 ～ 30℃，故确定以280℃为宜。

1.2.3.7 进样口温度：分别于进样口温度为260、280、300℃下进样分析，主成分相对含量几乎无差别，考虑到进样口温度比样品分析最高温度约高20℃，确定以280℃为宜。

通过上述筛选，最终确定气相色谱-质谱联用的分析色谱条件，气相色谱：SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛细管色谱柱，进样口温度280℃，接口温度280℃，载气为氦气，流速0.8 mL/min，分流比5∶1。升温程序：柱始温80℃，保持2min，以10℃/min速率升到110℃，再以5℃/min升温至280℃，保持2min。质谱：离子源电压70eV，离子源温度250℃，进样量1.0μL；质量扫描范围45～550m/z；溶剂峰切除时间为2.5min，质谱检测起测时间为3.0min。质谱图计算机检索数据库：NIST谱库检索。

2 结果

采用气相色谱-质谱联用方法对干燥七叶树花的挥发油提取物进行分析，其总离子流图结果如下：

通过分析比较，确定色谱条件筛选后的气相色谱-质谱联用分析方法对色谱峰可以达到较好的分离。新鲜七叶树花及干燥花苞的挥发油提取物也采用同样方法进行测定。通过计算机谱库检索及核对质谱图，鲜花、干花、花苞及酶水解后的鲜花、干花、花苞挥发油提取物的化学成分分析见表1。

表1 新鲜、干燥七叶树花及其干燥花苞的化学成分分析

注：*代表加β-葡萄糖苷酶组

本次实验从新鲜七叶树花的挥发油提取物中确证了44个化合物，从七叶树干花的挥发油提取物中确证了27个化合物，从七叶树花苞的挥发油提取物种确证了34个化合物。

由表1可知，在新鲜七叶树花挥发油中的含有许多醇类及酸类物质，其主要成分为反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇(10.34 %)、反式氧化芳樟醇(8.94%)、芳樟醇(8.30%)、邻二甲苯(7.67%)、棕榈酸(6.79%)、桃金娘烯醇(5.74%)等。在干燥七叶树花挥发油中主要物质也含有许多醇类及酸类物质，其主要成分为6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(16.10%)、邻苯二甲酸二丁酯(9.10%)、邻苯二甲酸酯(8.89%)、壬醛(8.74%)、(3R,6S)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢化吡喃醇(7.55%)、庚醛(6.18%)等。在七叶树花苞挥发油中主要成分为醇类、其主要成分有有冰片(29.18%)、桃金娘烯醇(5.96%)、植物醇(4.84%)、(3R,6S)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢化吡喃醇(4.07%)、邻苯二甲酸二丁酯(3.72%)、花生酸(3.71%)等。

通过表1的对比，可知在鲜花中β-葡萄糖苷酶存在作用。对比可知在加入β-葡萄糖苷酶后棕榈酸、正十二烷、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮的相对含量分别增加12.99%、4.86%、1.39%，增长率达到191.43%、260.44%、32.25%。同时植物醇、反式-橙花叔醇、紫苏醛、和金欢醇、冰片、雪松醇等物质的相对含量也有所增加。同时可以观察到反式氧化芳樟醇、顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、桃金娘烯醇及反式芳樟醇等物质的相对含量出现明显降低。

干花通过表1比较可知，在干花中加入β-葡萄糖苷酶反应，6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、异丁香酚、香叶醇、(R)-(+)-β-香茅醇、反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、茉莉酮、苯乙醛的相对含量有所增加，6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、异丁香酚、香叶醇及(R)-(+)-β-香茅醇的增加量较多分别为5.50%、0.59%、0.36%、0.27%，增长率分别达到了34.14%、62.46%、16.47%、25.27%，干花中其余物质含量均下降。

通过对比表1花苞结果，可知在花苞中加入β-葡萄糖苷酶后部分化合物的含量有所增加，其中棕榈酸相对含量显著增加5.24%，增加率达到174.07%，同时2-异丙基-5-甲基-1-庚醇相对含量增加3.26%，增加率达到592.59%。还可以观察到甲基庚烯、(3R,6S)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢化吡喃醇、桃金娘烯醇、香叶醇、紫苏醇、丁香酚、茉莉酮等成分均有所增加，但是其余成分的相对含量均有所减少，其中冰片相对含量出现明显减少，达到3.92%。

3 结论

通过建立并优化七叶树花挥发油的气相色谱-质谱联用分析方法，测定了其鲜花、干花及干燥花苞挥发油的化学成分主要以醇类化合物为主，为进一步开发和利用七叶树资源提供了理论依据。同时通过对七叶树花挥发油的成分分析，可知其含有很多香精类成分，例如桃金娘烯醇、香叶醇、紫苏醇、丁香酚等，而β-葡萄糖苷酶则可以促进鲜花及花苞中这些香精类成分的释放，且其对花苞的作用强度大于鲜花，这证明了β-葡萄糖苷酶可水解鲜花及花苞的香气前体物质，释放出鲜花中潜在的香气成分，但由于β-葡萄糖苷酶的加入，致使某些香精类成分含量有所减少，推测其只能增加七叶树花中的某些特定成分，而不能使全部香精成分的相对含量增加，故其对七叶树花的增香作用并不明显。