基于显色反应的神经性毒剂检测方法研究进展

刘国宏，黄婷婷，于竞翔

(陆军防化学院 化学防护系，北京 102205)

神经性毒剂是毒性最强的化学战剂，主要包括沙林(GB)、梭曼(GD)、塔崩(GA)、维埃克斯(VX)等。神经性毒剂比糜烂性毒剂、窒息性毒剂和全身中毒剂的毒性大，成为恐怖主义者最常用的化学战剂[1]。当今社会，化学恐怖从潜在威胁转向现实威胁的趋势日益明显。化学恐怖袭击危害严重，造成的社会和政治影响大，恐怖分子视化学恐怖为“杀手锏”。目前，世界上已发生多起神经性毒剂恐怖事件，例如1995年震惊世界的东京地铁沙林事件，大量人员受难[2-4]；2017年金正男在吉隆坡机场因中神经性毒剂VX身亡[5]。现场快速检测有利于神经性毒剂的早期发现和后期处置，因此，发展一种便携式、可现场检测神经性毒剂的方法非常必要。

现有的神经性毒剂检测方法主要有色谱法(气相色谱[6]、液相色谱[7]、毛细管电泳[8])、波谱法(红外光谱[9]、拉曼光谱[10-13]、核磁共振法[14]等)、质谱法[15]、催化发光法[16-17]、质量传感器[18]、离子迁移谱[19]、显色法[20-22]等。色谱、波谱以及质谱等方法通常在实验室使用，这些分析方法大多仪器昂贵，需将样品取至实验室进行分析，虽检测结果精确，但费时费力，不易现场检测；催化发光、质量传感器、离子迁移谱等方法可用于现场检测，但存在使用限制，选择性不高，携带不便，使用方式复杂，存在定性不准确或不能定量等问题。显色法基于显色反应，反应现象直观，成本相对低廉，适合现场快速检测[23]。本文从基于显色反应的神经性毒剂检测方法的原理、检测手段和显色剂三方面综述了显色法在神经性毒剂检测中的应用现状，总结了其发展趋势，提出了显色法在神经性毒剂检测中的研究方向。

1 基于显色反应的神经性毒剂的检测原理

特异性化学显色、酶催化反应、纳米粒子修饰等均可应用于基于显色反应的神经性毒剂检测。在特异性化学显色中，利用许乃曼反应，神经性毒剂可与过氧化物生成过氧磷酸，过氧磷酸进一步氧化联苯胺后显色[24]。在酶催化反应中，乙酰靛酚类化合物可作为胆碱酶是否被抑制的指示剂[25]。Climent课题组则采用巯基和脂肪醇修饰的硅纳米粒子对神经性毒剂模拟剂进行显色检测[26]。近年来，显色类试剂或传感器[27]在神经性毒剂检测方面受到了关注。上述基于显色反应的神经性毒剂检测方法虽然研究内容不同，但其反应原理一致，或基于与磷原子的亲核取代，或基于生化反应，主要是利用神经性毒剂对胆碱酯酶的抑制进行显色检测。

1.1 基于亲核取代的显色反应检测原理

1944年，许乃曼在塔崩试剂的侦检分析时发现，碱性的过氧化氢溶液加入到塔崩溶液中后，能使化学发光试剂发光，也能使邻甲基苯胺发生颜色变化，该反应被称为许乃曼反应[28]。1957年，Sass等[29]在此基础上，对含磷化合物(塔崩、沙林)进行显色反应研究，探索出许乃曼反应的机理，即：有机磷毒剂与过氧化氢发生亲核取代反应，生成过氧磷酸，过氧磷酸氧化联苯胺类，进而发生颜色改变。

有机磷毒剂与吡啶、苯胺类也能发生亲核取代。2011年，西班牙的Royo和Costero等[30]合成了含有N，N-二甲基苯胺供电子基团和偶氮桥连接的吡啶电子受体基团的分子。该分子中的苯胺和吡啶均能与带有强离去基团的磷酸酯或膦酸酯发生反应。根据生成物颜色的不同可以判断该磷酸酯是否带氰基团。2012年，该研究组以合成的2种三芳基甲烷类衍生物作为检测指示剂，利用三芳基离子上的亲核基团，攻击其磷酸酯或膦酸酯的磷原子中心，使其脱去P-X键后脱去磷酸，发生内环化[31]。

同年，厦门大学的研究人员基于羟基与神经性毒剂的亲核取代反应[32]，采用罗丹明染料作为指示剂进行显色研究，该研究采用罗丹明B与5-氨基-1-戊醇发生甲酯氨解生成N-罗丹明B-内酰胺-5-氨基-1-戊醇(dRB-APOH)。内酰胺上的羟基与氟磷酸酯发生亲核取代，然后发生环化反应，最终使该合成染料发生荧光性质和颜色上的改变。

在二吡咯(BODIPY)染料上连接羟基合成的化合物，也可用于神经性毒剂检测。2013年，研究者在BODIPY染料的基础上合成了用于神经性毒剂检测的显色指示剂，利用合成化合物上的羟基与有机磷毒剂发生亲核取代反应，生成荧光性质、颜色变化的产物，以达到检测神经性毒剂的目的[33]。

1.2 基于生化反应的显色反应检测原理

神经性毒剂进入人体后作用于神经系统，通过抑制胆碱酯酶活性从而引起乙酰胆碱的蓄积，使胆碱能神经过度兴奋，最后导致呼吸、循环系统衰竭死亡[34]。神经性毒剂经酶催化水解后产物或因结构改变致使本身颜色发生变化，或因与加入的其他物质发生反应使颜色间接发生变化，可通过反应前后的颜色变化判断神经性毒剂是否存在[35]。

除了酶与底物直接反应生色或间接反应生色的方法外，纳米材料的应用也提供了一种基于生化反应检测神经性毒剂的新思路。2005年，以色列研究人员Pavlov等[36]利用抑制剂对乙酰胆碱酯酶(AchE)的作用来刺激金纳米粒子的生长，研究了神经性毒剂的显色检测方法。2009年，Virel等[37]基于神经性毒剂抑制胆碱酯酶水解乙酰胆碱的原理，研究出一种能控制Ag-Au纳米粒子生长的反应体系，以达到检测神经性毒剂的目的。与Pavlov等的检测方法不同，该研究组通过Ag-Au纳米粒子的生长来判断神经性毒剂是否存在。硫代胆碱(Tch)在抗坏血酸存在下能控制Ag-Au纳米粒子的制备。Virel等建立了一个含有AgNO3、乙酰胆碱酯酶、Au纳米粒子(2～3 nm)、L-抗坏血酸和分解底物乙酰胆碱的水溶液体系,在该体系中，乙酰胆碱酯酶水解乙酰硫胆碱生成硫代胆碱，硫代胆碱抑制L-抗坏血酸与Ag+反应生成Ag，导致Ag-Au纳米粒子不再继续生长。而当神经性毒剂抑制了乙酰胆碱酯酶活性，使硫代胆碱不能生成，则L-抗坏血酸与Ag+反应生成Ag，覆盖Au纳米粒子，此时Ag-Au纳米粒子继续生长，溶液产生裸眼可见的颜色变化，据此建立了检测微量神经性毒剂的方法。

与控制纳米粒子的生长不同，2012年我国军事医学科学院的研究人员基于神经性毒剂对AchE的抑制作用，在硫辛酸修饰的金纳米粒子复合物上建立了神经性毒剂和高毒有机磷农药显色的超灵敏检测方法[38]。该方法中AchE水解ATch生成Tch，诱发硫辛酸修饰的金纳米粒子复合物颜色从红色变为蓝色。有机磷农药作为抑制剂，可以抑制Tch的生成，颜色变化因毒剂不同而不同，如图1所示。

图1 硫辛酸修饰的金纳米粒子复合物检测神经性毒剂的机制图[38]Fig.1 Schematic illustration for the detection of nerve agents based on the aggregation[38]

2 基于显色反应的神经性毒剂检测手段

基于显色法的神经性毒剂检测方法的研究起步较早，自20世纪神经性毒剂出现开始，其检测方法不断发展，可分为裸眼检测、紫外-可见光检测、荧光检测等。

2.1 裸眼检测

裸眼检测无需借助任何仪器，肉眼可直接观察到显色反应前后颜色的变化，从而判断有无神经性毒剂存在。El Sayed等[39]合成的显色探针在氟膦酸二异丙酯(DFP)下有明显区别于塔崩模拟剂氰基膦酸二乙酯(DCNP)的黄色变化；Gotor等[31]在三芳基甲烷染料的基础上合成了带羟基的衍生物，以其为探针与DFP进行亲核取代，在水与乙腈混合溶液中检测DCNP和DFP，前者由无色变为绿色，后者从无色变为红色；带有罗丹明染料的指示剂在反应前后的颜色变化很明显[32]；用BODIPY染料合成相应指示剂后，Climent等[40]观察到反应前后体系颜色由粉色变为灰黄色。

裸眼检测可判断物质的性质并对物质进行初步的半定量，结果直观，操作简单。但人眼辨识度低，因此基于人眼观察的裸眼检测准确度低，光学仪器的应用则增加了其准确性。

2.2 紫外-可见光检测

紫外-可见光检测也是基于显色反应判断神经性毒剂是否存在的一种手段，其工作波长在200～800 nm范围内，用途广泛。Royo等[30]用紫外-可见光光谱检测3种不同颜色的反应体系：指示剂、指示剂与氯磷酸二乙酯(DCP)、指示剂与DCNP，3种体系分别呈桔、玫红、黄色，在紫外-可见光光谱下可明显看到其吸收带和波谱的差异，对照体系吸收峰高可获得相应浓度。Costero等[41]合成的推拉染料指示剂与DCP反应后光谱吸收峰增强，波长蓝移。Gotor等[31]用紫外-可见光光谱检测合成的三芳基甲烷衍生物指示剂，发现指示剂与DCNP和DCP反应后的光谱图差异大，以此判断指示剂的检测性能。

紫外-可见光检测工作范围广泛，是一种常见的显色法研究手段，也能通过光谱差异辨识物质。

2.3 荧光检测

化合物的荧光猝灭现象可作为判断被测物种类的依据，为提高分辨率，可采用荧光光度仪进行检测。Climent课题组将BODIPY染料用于神经性毒剂的检测，在荧光光度仪下，其颜色由桔色变为灰绿色，DFP的信号显著减少，发生了荧光猝灭现象[40]。Barba-Bon等[33]也进行了基于BODIPY染料检测神经性毒剂的研究，除了观察到颜色变化，还检测到荧光波长在反应前后的变化。Wu等[32]在罗丹明染料基础上合成了一种指示剂，当其与神经性毒剂反应时可以明显观察到荧光增强现象。

荧光检测比裸眼检测、紫外-可见光检测更灵敏，人眼无法准确辨别的颜色区别，在荧光检测下信号差异明显，更易判断。

3 用于神经性毒剂显色检测的物质

神经性毒剂本身无颜色，反应前后通常不会变色，反应体系中需存在能指示反应前后颜色变化的物质。该物质可直接与神经性毒剂发生反应产生颜色变化，也可与神经性毒剂的反应产物发生反应产生颜色变化。

3.1 联苯胺类、肟试剂

联苯胺是在许乃曼反应中发现的显色剂，过氧磷酸氧化联苯胺后使联苯胺发生颜色变化。能与神经性毒剂反应的肟试剂为α-含氧醛肟或酮肟，该试剂可与神经性毒剂发生二级Beckmann反应，生成HCN和相应羧酸，可通过显色法检测CN-和羧酸来检测神经性毒剂[42]。Kumar等[43]使用以吡啶、咪唑和肟等为主要官能团的显色剂，如苯胺类[24]、米氏酮肟试剂[44]，建立了神经性毒剂的显色反应检测方法。

3.2 染 料

染料本身有颜色，能在反应前后发生颜色变化，如三芳基甲烷染料、罗丹明染料、BODPIY染料等。这些染料本身不带能与神经性毒剂发生亲核取代的基团，经人为修饰或合成其衍生物后，可用于神经性毒剂的检测。2010年，西班牙瓦伦西亚大学研究人员[45]用二芳基甲烷衍生物合成了一系列三芳基甲烷衍生物，然后在乙腈或乙腈-水溶液(3∶1)中反应后进行显色检测，原理是基于三芳基甲烷衍生物羟基的磷酸化和去磷酸化，生成碳正离子，结构的改变导致吸收带发生红移。同年，该课题组对具有共轭π键的推拉式染料检测神经性毒剂模拟剂的显色检测方法进行了研究，这种具有共轭π键的推拉式染料结构，能够在膦酸酯底物存在时发生酰化作用，然后进一步发生分子N-烷基化作用[41]。该法通过特定发色团染料受体与发色团染料结合制作显色法检测神经性毒剂的探针分子，神经性毒剂模拟剂能触发该推拉式染料的环化反应，将二甲胺盐转变为季铵盐。在乙腈或与乙腈-水溶液(3∶1)中反应后该染料的紫外吸收带发生蓝移，基于此可将其用于神经性毒剂的测定。

罗丹明具有内酰胺结构和特殊的光学物理特性，能用于神经性毒剂的检测。罗丹明在与神经性毒剂反应的过程中能可逆地打开酰胺螺环，变成具有高荧光特性的化合物。我国军事医学科学院研究人员合成了能与神经性毒剂反应的罗丹明化合物dRB-APOH，其与神经性毒剂模拟剂发生磷酸化反应后，生成中间产物，再发生环化反应生成内酰胺产物。无荧光特性和无色的合成指示剂与神经性毒剂发生反应后，能生成具有高荧光特性和颜色的物质，从而实现神经性毒剂的测定[32]。

二吡咯(BODIPY)可以吸收可见光范围的光。2016年，德国、捷克、西班牙的研究人员以BODIPY染料为基础，合成了能快速检测塔崩、沙林和梭曼等神经性毒剂的BODIPY改良硅材料[40]。该研究将荧光指示剂BODIPY键合到硅介孔微球(SBA)合成混合指示剂，SBA可使该混合指示剂具有更高的反应性和稳定性。该混合指示剂在神经性毒剂作用下从粉色变为灰黄色，并可在数秒内实现对浓度为μg/m3范围内的神经性毒剂的检测。Royo团队研究发现吡啶与神经性毒剂的亲核反应可用于检测神经性毒剂[30]，2017年，Kim等[46]在此基础上合成了meso-Pyridyl-BODIPY化合物(m-py-BOD)，m-py-BOD与DCP或DECP共存于乙腈溶液时，颜色由黄色变为粉色，荧光特性发生改变。2018年，山东大学的研究人员设计并合成了一种快速响应的荧光探针，探针包含一个电子供体-受体体系，其中BODIPY部分起报告基团和羟基的作用，羟基作为神经介质模拟物的反应位点，反应前后探针的荧光特性和颜色皆发生改变，从而实现神经性毒剂的测定[47]。

3.3 配合物

有些配合物具有独特的物理化学性质，能与神经性毒剂反应并发生颜色、荧光性质的改变。目前基于该性质用于检测神经性毒剂的常用配合物是以镧系元素作为中心原子的配合物。镧系元素与特定配体结合生成的配合物具有荧光特性，这些配合物可与神经性毒剂反应发生荧光猝灭，以此对神经性毒剂进行检测。

Menzel等[48]构建了镧系元素的配合物，建立了裸眼检测神经性毒剂模拟剂氟膦酸酯的方法。该配合物由铕离子(Eu3+)与四噻吩甲酰三氟丙酮(TTFA)双齿配体组成(Tb3+与TTFA和邻啡咯啉(Op)生成双齿混合配合物)。TTFA配体在近紫外光照射下发出红光，而Op配体在远紫外光照射下发出绿光。在这些感光配体的辅助下，经紫外灯照射可观察到镧系配合物发光。水合分子对镧系配合物有强烈的荧光猝灭作用，使用前需对Op镧系配合物和TTFA镧系配合物形成的薄膜进行干燥，薄膜在干燥后暴露在氟的气氛下很快发生荧光猝灭，该方法能裸眼检测神经性毒剂模拟剂氟膦酸酯。2008年，Shunmugam和Tew采用三联吡啶与镧系元素反应生成配合物[49]，G类毒剂会使该配合物发生荧光猝灭，从而达到检测目的。此外，研究人员还探讨了三联吡啶与镧系元素形成多种配合物的荧光特性。G类毒剂模拟剂氯膦酸二乙酯(SAS-Cl)与三联吡啶镧系配合物发生反应生成的产物能发出红色荧光，其他有机磷化合物的颜色不一样，且SAS-Cl信号强。该方法能从一系列有机磷化合物中识别出SAS-Cl。该研究找到了一种检测G类毒剂的新型、简单、敏感、高选择性的配合物。

3.4 纳米粒子复合物

两种或两种以上不同物质所形成的结合体，能表现出单一材料不具备的性质，而纳米粒子本身具有许多不同于微观粒子和宏观物体的特性。随着纳米技术的发展，纳米粒子复合物显色剂也应用于神经性毒剂的检测中。

2010年，西班牙瓦伦西亚理工大学Climent等[50]对双功能化二氧化硅纳米粒子的传质控制作用在神经性毒剂显色检测上的应用进行了研究。合成的纳米二氧化硅表面有巯基(—SH)、羟基(—OH)两个活性亚基，正常情况下，这两个亚基是方酸染料(SD)反应亚基，巯基与SD中间缺电子的四圆环反应诱导使芳香性减弱。—OH亚基与神经性毒剂发生反应，会抑制SD与—SH的反应，从而发生颜色变化。这两个反应均基于亲核进攻。巯基因亲核性强而与SD反应，但分子空间位阻和结构阻碍了—SH与亲电的模拟剂的磷原子反应。反应过程如图2所示。含有SD的修饰硅纳米粒子溶液暴露在DFP条件下，颜色为深蓝色，而对照组为淡蓝色。该课题组将金纳米粒子应用于神经性毒剂模拟剂检测，探索了金纳米粒子聚集与分散时的颜色变化[51]。采用三芳基甲烷染料修饰金纳米粒子，在神经性毒剂模拟剂存在时，三芳基甲烷可被转换成相应的碳正离子，并引起强烈的颜色改变，纳米粒子表面的电荷补偿，能使纳米粒子在溶液中聚集，从而产生颜色变化[52]。

图2 双功能二氧化硅纳米粒子检测神经性毒剂模拟剂作用机制[51]Fig.2 Mechanism of the detection of nerve agent mimics based on bifunctionalized SiO2 nanoparticles[51]

4 展 望

基于显色反应的检测方法是一种重要的神经性毒剂检测方法，但目前仍有许多不足。在显色原理上，许乃曼反应中强氧化剂也能使联苯胺类生色，造成干扰；检测方法方面，便携式的分光光度计稳定性差，结果误差大；显色剂方面，基于纳米粒子团聚的颜色变化，即使在无神经性毒剂存在的情况下，无机盐超过一定浓度时，也会引起纳米粒子的团聚，发生颜色改变，造成假阳性。为提高显色法的灵敏度、抗干扰能力和特异性，基于显色反应的神经性毒剂检测方法尚需进一步的研究，其发展趋势包括：(1)寻找新的显色反应检测神经性毒剂的原理，例如免疫抗体法，以提高检测的选择性和灵敏度；(2)现有的现场检测手段简单，发展新型、便携式的检测仪器有利于现场检测，提高检测方法的准确性；(3)现有的显示剂不能完全满足检测要求，需研究新型显示剂，寻找反应前后颜色变化明显、光学物理性质独特、选择性好、灵敏度高的显示剂。