松香多元酸对小地老虎的拒食活性研究

许 吉, 翟兆兰, 宋湛谦, 商士斌,2, 饶小平,2*

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室， 江苏 南京 210042； 2.中国林业科学研究院 林业新技术研究所， 北京 100091)

小地老虎(Agrotisypsilon)，又名土蚕、切根虫，分布于全国各地，是杂食性害虫，食性较广，不仅危害棉花、玉米、小麦、高粱等农作物，而且也危害水曲柳、胡桃楸及红松等林木幼苗[1]。目前对小地老虎主要采用化学农药防治方法，主要农药种类包括菊酯类和有机磷类，但化学农药的广泛使用不仅会污染环境，同时也容易使害虫产生抗药性[2]。随着现代农业和生态环境保护对无公害农药的迫切需求以及有害生物综合治理共识的形成，昆虫拒食剂因具有使用安全、对环境友好、不易产生抗药性等优点而越来越被重视，成为无公害农药中的重要品种[3]。昆虫拒食剂不直接杀灭昆虫，而是主要通过干扰昆虫的取食行为达到保护作物的目的，因此昆虫拒食剂的使用不会造成生态链的破坏[4>-5]。常见的昆虫拒食剂包括萜类、生物碱、酚类、醌类、香豆素类、糖类等不同类型的化合物，主要是通过提取分离植物次生物质来获得，其中萜类化合物是研究最多的一类拒食剂，萜类拒食剂主要包括单萜类、倍半萜类、二萜类和三萜类[6>-10]。通过对天然产物中的主要成分进行结构修饰，可以大大提高其生物活性。松香是一种具有重要价值的天然萜类树脂，是由松树分泌的松脂经过蒸馏分离而得，松香的主要成分是树脂酸，树脂酸的结构中含有共轭双键及羧基，可以通过加成、酯化等化学反应引入一系列的官能团。松香具有三环二萜结构，是生物医药及生物农药的良好起始原料[11]。前期研究发现，脱氢枞酸的酯类衍生物对粘虫、蚜虫等害虫具有一定的拒食活性，松香酸离子液体衍生物对鲎虫、赤拟谷盗虫和谷斑皮蠹等农作物害虫具有较强的拒食效果[12>-13]。本研究以松香为原料经Diels-Alder加成反应合成丙烯海松酸、富马海松酸及马来海松酸等松香多元酸，研究了其对小地老虎的拒食活性，以期为筛选出高活性的植物源昆虫拒食剂提供参考。

1 实 验

1.1 松香多元酸制备

根据文献[14～17]的方法合成及提纯脱氢枞酸、丙烯海松酸、富马海松酸和马来海松酸。由于松香树脂酸结构中含有共轭双键，与不饱和酸进行Diels-Alder加成反应后可以得到松香多元酸。松香与丙烯酸加成产物为丙烯酸松香，经过钠盐法重结晶可得到丙烯海松酸[15]，松香与富马酸加成产物为富马酸松香，经过钠盐法重结晶得到富马海松酸[16]，松香与马来酸酐加成产物为马来松香，马来松香经过溶剂重结晶可以得到马来海松酸[17]。为了研究松香多元酸结构变化对拒食活性的影响，将3种松香多元酸与未加成的脱氢枞酸进行活性对比。松香多元酸及脱氧枞酸的结构如图1所示。

图1 松香多元酸及脱氢枞酸的结构Fig. 1 Structure of polyacid derivatives of rosin and dehydroabietic acid

1.2 供试幼虫和植物的培养

小地老虎(Agrotisypsilon)为室内继代人工饲养。饲养条件：温度(25±1) ℃，相对湿度(75±5)%，光周期为光照16 h、黑暗8 h(L16∶D8，h∶h，下同)，培养10天。选择大小整体一致的4龄初幼虫供试。甘蓝(BrassicaoleraceaL.)为温室人工栽培，未接触任何化学药剂。

1.3 样品对小地老虎4龄幼虫的拒食率测定

采用浸叶法进行拒食活性的测定。用少量乙醇溶解样品，然后用0.1%吐温-80水溶液配成质量浓度1.0 g/L的样品溶液作为试验组测试，0.1%吐温-80水溶液作为对照组进行测试。将新鲜甘蓝叶片洗净、晾干，用打孔器打成直径2.0 cm，面积为314 mm2的叶碟，分别在质量浓度为1.0 g/L的药液中浸泡10 s后，取出自然风干，放入12孔养虫板中，每孔1片共放10个孔(10组实验)，分别接入1只饥饿处理4 h的生长一致的4龄小地老虎幼虫。将试虫置于(27±1) ℃、相对湿度(75±5)%、光周期L16∶D8条件下，用浸泡处理后的叶碟对幼虫进行饲养，于24 h后将残存的叶碟取出，用1 mm×1 mm标准方格纸分别测量试验组和对照组叶碟剩余面积，取平均值计算拒食率。拒食率(%)=(对照组取食面积试验组取食面积)/对照组取食面积×100%。

1.4 松香多元酸对小地老虎4龄幼虫的拒食中浓度测定

将丙烯海松酸和富马海松酸分别用0.1%吐温-80水溶液稀释配制成3～4个系列浓度，将制得的新鲜甘蓝叶碟分别在各浓度药液中浸泡10 s，取出自然风干，放入12孔养虫板中，每孔1片共放10个孔，分别接入饥饿处理4 h的生长一致的4龄小地老虎幼虫，每孔1头试虫。以0.1%吐温-80水溶液为对照。将处理后试虫置于(27±1) ℃、相对湿度(75±5)%、光周期L16∶D8条件下，对幼虫进行饲养，于24 h后将残存的叶碟取出，利用1 mm × 1 mm标准方格纸分别测量试验组和对照组叶碟剩余面积，计算拒食率。拒食率为50%时的样品浓度即拒食中浓度(AFC50)的计算方法参照陈立等[18]的方法，将拒食率转化为概率值y、衍生物质量浓度转化成对数x，利用DPS v7.05软件得到拒食率回归方程y=ax+b，其中b表示回归方程的截距，a表示回归方程的斜率，并用该回归方程计算拒食率为50%时的样品质量浓度，即拒食中质量浓度(AFC50)。使用DPS v7.05处理试验数据，求得平均值和标准误(SE)，差异显著性采用Tukey法进行比较。

2 结果与讨论

2.1 样品对小地老虎的拒食率

松香多元酸及脱氢枞酸对小地老虎的取食面积及拒食率列于表1中，试验中发现质量浓度为 1.0 g/L 的样品对小地老虎幼虫无致死作用。由表中数据可以看出，丙烯海松酸及富马海松酸处理过的叶蝶中，小地老虎的取食面积大大减少，在1.0 g/L质量浓度下拒食率分别为78.41%和79.94%，较大地抑制了幼虫的取食；马来海松香表现出微弱的拒食活性，拒食率为13.41%；而未加成的脱氢枞酸拒食率仅为0.68%，几乎无拒食作用。由此可见，脱氢枞酸结构中有一个羧基，拒食活性较弱，丙烯海松酸及富马海松酸结构中分别含有2个和3个羧基，具有较强的拒食活性，而马来海松酸中含有一个羧基及一个酸酐结构，拒食活性也较弱。样品对小地老虎的取食面积标准偏差及95%置信区间(95%置信区间就是总体参数在这个范围的可能性大概是95%,或者说总体参数在这个范围,但其可信程度只有95%)数据列于表2中，从表中数据可以看出，马来海松酸对小地老虎取食面积测试结果标准差较大，测试结果的离散程度较大，而丙烯海松酸和富马海松酸的标准差较小，测试结果的离散度较小，说明丙烯海松酸和富马海松酸的测试结果代表性更好。

表1 样品对小地老虎的取食面积及拒食率

表2 样品对小地老虎的标准偏差及95%置信区间

2.2 松香多元酸对小地老虎的拒食中浓度

初筛结果表明丙烯海松酸、富马海松酸对小地老虎具有较强的拒食作用，因此对这2种松香多元酸进一步研究，测定了不同质量浓度的松香多元酸样品对小地老虎4龄幼虫的拒食率，进一步计算拒食中质量浓度(AFC50)。不同质量浓度松香多元酸对小地老虎的拒食率列于表3中。由表3数据可见丙烯海松酸、富马海松酸对小地老虎的拒食率随着质量浓度的增加相应提高。丙烯海松酸、富马海松酸对小地老虎的拒食率回归方程分别为y1=6.29x+0.89和y2=6.20x+1.01,拒食作用相关系数及95%置信区间如下：相关系数分别为0.989 2和0.987 4，说明2种化合物的拒食活性与质量浓度关系密切，拒食中质量浓度(AFC50)分别为0.04和0.06 g/L，95%置信区间分别为0.02～0.05及0.05～0.09 g/L，丙烯海松酸的拒食中质量浓度稍低于富马海松酸。

表3 不同质量浓度松香多元酸对小地老虎的拒食率

目前对小地老虎的防治主要采用化学农药防治方法，主要化学农药包括菊酯类及有机膦类，容易造成环境恶化、生态链破坏及害虫产生抗药性。而使用拒食剂这种环保农药对小地老虎的防治目前报道较少，吕敏[19]研究了从芸香科植物白鲜根皮中分离得到的梣酮对小地老虎的拒食活性，其中梣酮具有四降三萜骨架上的呋喃环和C，D-环结构，是研究较多的一种天然降解的柠檬苦素类似物，梣酮对2龄小地老虎幼虫24 h时的拒食中质量浓度(AFC50)值为13.40 g/L。Jeyasankar[20]研究表明，植物精油、桉叶油及白珠油对小地老虎有较强的拒食活性，2%时拒食率分别达到92.245%及87.21%，拒食中浓度在0.5%～1%之间。相比之下，丙烯海松酸及富马海松酸对小地老虎的拒食活性比梣酮、白珠油及桉叶油的活性强。

松香多元酸对小地老虎4龄幼虫具有较高拒食活性，可有效降低小地老虎的取食量，减轻其对寄主植物的危害。丙烯海松酸、富马海松酸对小地老虎的拒食中质量浓度较低，下一步将进行田间试验，以明确其在生产中的实际防治效果。

3 结 论

3.1研究了松香多元酸丙烯海松酸、富马海松酸、马来海松酸对小地老虎(Agrotisypsilon)的拒食活性，同时与未加成的脱氢枞酸进行活性对比。结果表明：质量浓度为1.0 g/L时脱氢枞酸、丙烯海松酸、马来海松酸和富马海松酸对小地老虎的24 h拒食率分别为0.68%、 78.41%、 13.41%和79.94%。其中，丙烯海松酸及富马海松酸对小地老虎的拒食活性较高，较大地抑制了幼虫的取食，马来海松酸的拒食活性较弱。

3.2研究了丙烯海松酸及富马海松酸对小地老虎的拒食中质量浓度(AFC50)，结果表明二者均具有较低的AFC50，AFC50分别为0.04 和0.06 g/L，其拒食活性比梣酮、白珠油及桉叶油强。