云南丽江和吉林靖宇11种越橘果实花色苷组分的分析

臧慧明,吴 林,2,*,徐德冰,2,王雪松,张 强

(1.吉林农业大学园艺学院,吉林长春 130118;2.吉林省普蓝高科技有限公司,吉林长春 130000;3.北京电子科技职业学院生物工程学院,北京 100176)

蓝莓,学名越橘,杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)植物,多年生落叶或常绿灌木小浆果类果树。蓝莓果实中含有花色苷、原花青素、黄酮类、超氧化物歧化酶(SOD)、熊果酸等活性成分,被誉为“浆果之王”[1]。蓝莓原产北美,广泛分布于北半球,1981～2000年,吉林农业大学等研究机构陆续从美国等国家大量引种蓝莓,促使蓝莓产业得到发展。我国蓝莓的生产可规划为6个产区,包括长白山、大兴安岭、辽东半岛、长江流域、华南产区和西南产区,现阶段各产地将引种表现,田间管理措施作为研究重点,对蓝莓果品品质的研究较少[2]。

迄今为止,存在的植物花色苷有500多种,花青素有20余种。蓝莓中主要有5种花青素,并且与半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖等以糖苷键结合而成蓝莓果实中的15种花色苷,同时在酸水解的作用下重新转化为5种花青素[3]。蓝莓花色苷具有很强的生物活性,近年来,随着蓝莓的普及,人们开始研究蓝莓的保健功效。研究表明,蓝莓花色苷对H2O2所致血管内皮细胞凋亡具有保护作用[4],还可显著降低糖尿病小鼠的血糖含量和肝脏中的丙二醛含量(p<0.05)[5],并对大鼠心脏病理变化有不同程度减轻,对环磷酰胺致大鼠心脏毒性具有一定保护作用[6]。

花青素的分离提取方法主要有浸提、超声波、微波等,常用于纯化花青素的技术有柱层析、固相萃取、液相色谱、高速逆流色谱等。田密霞等[5]采用超临界CO2法萃取蓝莓花色苷,利用AB-8大孔树脂进行纯化,纯化后花色苷纯度为80.76%。张杨等[7]通过XAD-7HP大孔树脂与固相微萃取小柱纯化蓝莓果实,鉴定出11种花色苷。刘静波等[8]采用AmberliteXAD-7HP大孔树脂层析、Sep-Pak C18固相萃取和Sephadex LH-20凝胶色谱分离,所得蓝莓花色苷粗品的纯度为62.49%,经过半制备型高效液相色谱技术纯化飞燕草素-3-O-半乳糖苷和锦葵色素-3-O-半乳糖苷,纯度分别为96.98%和95.63%。由此可见,不同分离技术对花色苷作用明显,但过多的分离程序对花色苷的流失造成了一定的影响。因此,选择一种高效、低破坏度的分离方法成为研究的方向。

目前,对花色苷的检测方法较多,主要以pH示差法[9]、高效液相色谱法为主。pH示差法适用于含有干扰物体系中花色苷总量的测定[10]。高效液相色谱法能够很好的对花色苷进行定量分析[11],由于部分花色苷含量较低,通常使用高效液相质谱联用技术对花色苷进行定性,但同样存在干扰因素多,仪器、人员等外部因素,导致定量不准确的弊端[12]。因此,采用花色苷标准品的对照,通过高效液相色谱法进行定性和定量分析更为准确。

本研究旨在分析云南丽江和吉林靖宇11种越橘花色苷种类及含量的差异,了解区域性不同品种越橘的营养价值,以期为功能性品种的选育和产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

11种越橘果实(品种为：蓝丰、托柔、奥林匹亚、杜克、蓝乐、早蓝、雷戈西、奥尼尔、密斯蒂、北陆、布里吉塔) 采自2016年5～7月云南丽江、吉林靖宇普蓝高科蓝莓基地,每个品种选取3株正常生长的植株,每株随机摘取20个果实,果实采摘后放入-20 ℃冰箱保存;矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-半乳糖苷、飞燕草素-3-半乳糖苷标准品 均由上海源叶生物科技有限公司提供。

BT125D型分析天平 奥多利斯科学仪器有限公司;JP-100ST型超声波清洗机 深圳洁盟设备有限公司;隔膜真空泵 天津津腾有限公司;1200型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器) 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 精密称取5.0 g蓝莓鲜果,研钵研磨至泥状,加入0.2%盐酸水溶液50 mL,超声提取30 min,超声温度为30 ℃,超声频率为40000 Hz,过滤,滤渣利用上述方法再进行提取,合并滤液,定容至100 mL,过0.22 μm滤膜后上液相色谱仪检测。

1.2.2 标准溶液的配制 分别精密称取6种花色苷标准品1 mg,置于10 mL棕色容量瓶中,以1 mol/L盐酸甲醇溶液溶解,作为标准储备液,临用前用1 mol/L盐酸甲醇稀释成0.37～223 μg/mL的标准溶液。

1.2.3 色谱条件 液相条件:安捷伦Eclipse XDB-C18柱,5 μm,4.6×150 mm,流动相:A:10%甲酸水,B:甲醇,梯度洗脱:0～25 min,25%～30%B,流速:0.6 mL/min,检测波长:530 nm,柱温25 ℃;进样量10 μL。

1.2.4 精密度试验 吸取6种配制好的标准溶液，连续10 μL进样5次，测定峰面积。

1.2.5 加标回收率试验 取已知各花色苷含量的丽江蓝丰果实样品，按照1.2.1的方法制备样品，取1份加入纯净水作为对照组，加入不同质量浓度的花色苷标准品，进样量10 μL，测定花色苷含量，计算回收率。

1.3 数据分析

采用Excel 2003、SPSS 18.0对15个越橘样品的花色苷成分进行方差分析与聚类分析。

2 结果与分析

2.1 花色苷标准曲线绘制

以一定质量浓度梯度的花色苷混合标准溶液进样分析,以色谱峰面积(Y)对6种花色苷质量浓度(X)求回归方程和相关系数,结果如图1、表1所示。

表1 花色苷对照品标准曲线方程Table 1 Standard equations for anthocyanins

图1 花色苷混合标准品的色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed anthocyanins standards注:1:飞燕草素-3-半乳糖苷,2:飞燕草素-3-葡萄糖苷,3:矢车菊素-3-半乳糖苷4:矢车菊素-3-葡萄糖苷,5:锦葵色素-3-半乳糖苷,6:锦葵色素-3-葡萄糖苷。

由图1可见,飞燕草素-3-半乳糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-葡萄糖苷6种标准品峰型标准,分离效果良好,能够达到色谱分析的条件。由表1可见,6种标准品线性良好,相关系数为0.9939～0.9968。

2.2 精密度试验

测定6种标准溶液峰面积RSD为2.00%～3.73%,表明进样精密度良好,结果见表2。

表2 花色苷重复性试验结果Table 2 Repeatability for anthocyanins

2.3 加标回收率试验结果分析

如表3所示,6种花色苷平均回收率在98.90%～100.99%,表明花色苷标准品回收良好,此方法适用于提取液中各花色苷含量的测定,准确率较高。

表3 花色苷加标回收率实验结果Table 3 Spiked recoveries for anthocyanins

2.4 15个越橘样品花色苷含量分析

由表4可知,15个越橘样品中,均检测到的有飞燕草素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-半乳糖苷三种花色苷,其中飞燕草素-3-半乳糖苷平均含量为223.99 μg/g、锦葵色素-3-半乳糖苷平均含量为153.34 μg/g,二者占总花色苷含量的65%。飞燕草素-3-半乳糖苷含量最低为95.44 μg/g(丽江蓝丰),最高为428.07 μg/g(丽江雷戈西),锦葵色素-3-半乳糖苷含量最低为47.27 μg/g(吉林托柔),最高为362.72 μg/g(丽江雷戈西),6种花色苷变异系数为0.56～1.48,变幅较大,说明不同花色苷品种间差异较大。

表4 不同越橘花色苷含量分析(μg/g)Table 4 Analysis of anthocyanins contents in different blueberries(μg/g)

由图2可知,6种花色苷除飞燕草素-3-半乳糖苷与矢车菊素-3-半乳糖苷外,其余4种地区间差异显著(p<0.05),丽江地区锦葵色素-3-半乳糖苷显著高于靖宇地区(p<0.05),靖宇地区飞燕草素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-葡萄糖苷显著高于丽江地区(p<0.05)。飞燕草素-3-半乳糖苷平均含量最高,分别为220.49(吉林靖宇)、226.31 μg/g(云南丽江)。

图2 靖宇和丽江地区越橘中6种花色苷差异分析Fig.2 Variance analysis of 6 anthocyanins of Jingyu and Lijiang in blueberries注:不同字母表示同一种花色苷不同产地间差异显著(p<0.05);图3同。

2.5 不同地区同种越橘花色苷组分的分析

如图3所示,相同品种越橘不同地区的花色苷种类无差异,含量差异较大,这与丽江、靖宇地区的土壤、光照、环境、田间管理等因素有关。丽江蓝丰主要以锦葵色素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-半乳糖苷为主,靖宇蓝丰以飞燕草素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-葡萄糖苷为主。丽江托柔以锦葵色素-3-半乳糖苷为主,靖宇托柔只鉴定出3种花色苷,且含量较低,说明此品种种植在靖宇地区不利于花色苷的积累。奥林匹亚杜克均以飞燕草素-3-半乳糖苷为主,且靖宇地区含量远远大于丽江地区,说明奥林匹亚、杜克种植在靖宇地区更有利于花色苷的积累。

图3 四种越橘不同产地花色苷对比分析Fig.3 Comparative analysis of anthocyanins in 4 blueberries

2.6 不同越橘样品聚类分析

采用欧氏距离法对不同品种的花色苷组分特点进行聚类分析,结果如图4所示。当欧氏距离为5时,所测样本分为4个集群:集群1为飞燕草素-3-半乳糖苷含量较高的三种越橘,代表品种为丽江雷戈西、丽江奥尼尔、靖宇杜克;集群2为6种花色苷总含量较高的越橘品种,代表品种为丽江北陆与靖宇早蓝;集群3代表的越橘品种6种花色苷均有检出,集群4代表的越橘品种所含花色苷总量较低。当欧氏距离为6～20时,所测样本分为3个集群,且集群1与集群2无变化,集群1、集群2对不同越橘花色苷的贡献大,说明飞燕草素-3-半乳糖苷含量与花色苷总含量是评价越橘花色苷特点的重要因子。

图4 不同越橘的聚类分析树状图Fig.4 Cluster analysis dendrogram of different blueberries

3 讨论

越橘品种及地区差异会导致越橘果实中花色苷种类及含量有所不同[13]。天然花色苷由于色泽鲜亮、水溶性高,是水果中呈现颜色的主体物质[14-15]。研究表明,越橘中含量较高的花色苷是锦花葵素-3-半乳糖苷。Moze等[16]通过高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)鉴定不同产区蓝莓的花色苷,共15种,以锦花葵素与飞燕草素为主,含量最高的是锦花葵素-3-O-半乳糖苷。郭晓倩等[17]以东北野生蓝莓为原料,共鉴定出14种花色苷组分,飞燕草素衍生物是最主要的花色苷,占花色苷总量的34.89%～42.21%,牵牛花素衍生物25.96%～32.95%,锦葵素衍生物25.96%～32.95%。Brambilla等[18]测定不同蓝莓品种的果汁制品,共检出15种花色苷,其中锦葵花素-3-O-半乳糖苷含量最高。Burdulis等[19]对比了立陶宛、俄罗斯、瑞典等地区的越橘花色苷种类及含量,立陶宛地区的花色苷总含量最高,不同地区越橘中花色苷的种类没有差异。此外,越橘中花色苷的含量与海拔、光照、气候、温度等环境因素密切相关,花色苷种类受环境因素影响较小[20]。本文对云南丽江、吉林靖宇两个产区进行对比分析,共鉴定出6种花色苷,所测品种多以飞燕草素为主,锦葵花素为辅,发现蓝丰、杜克、托柔、奥林匹亚花色苷种类与地域无关,花色苷含量受地区性环境因素影响较大,导致花色苷含量呈显著性差异,这与前人研究相符。

4 结论

对越橘中花色苷进行分离提取和HPLC分析,飞燕草素-3-半乳糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-葡萄糖苷标准品线性良好,相关系数为0.9939～0.9968,精密度RSD为2.00%～3.73%,且平均回收率在98.90%～100.99%,该方法准确、高效,共鉴定出6种花色苷,含量较高的是飞燕草素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-葡萄糖苷,共占花色苷总量65%。通过聚类分析,表明集群1为飞燕草素-3-半乳糖苷含量较高的三种越橘,集群2为6种花色苷总含量较高的越橘品种,说明飞燕草素-3-半乳糖苷含量与花色苷总含量是评价越橘花色苷特点的重要因子。