紫娟茶花青素的抗氧化活性及稳定性

2018-10-16杨晓萍董昕阳曾维超

食品工业科技 2018年18期

王燕,冯瑛,杨晓萍,李洁,董昕阳,曾维超

(华中农业大学园艺林学学院茶学系,湖北省果茶办公室,湖北武汉 430070)

紫娟由云南大叶群体国家级茶树良种——勐海大叶种中单株培育而成[1],是云南大叶群体种中的一种珍稀优良品种。紫娟茶内黄酮类、咖啡碱、锌和表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基)没食子酸酯(EGCG3″Me)等物质的含量较高[2-3],且以花青素含量最为突出,其是使紫娟茶树茎、芽、叶及由其鲜叶加工而成的炒青绿茶茶汤汤色均为紫色的主要原因。研究表明紫娟茶具有很强的抗氧化活性、显著的降血压效果以及抗癌、降血糖、保护肝脏、提高记忆力等[2]功能,紫娟茶花青素在这些功能的发挥中起着重要作用。

花青素属于类黄酮化合物,是一类广泛存在于植物中的天然水溶性色素,因其具有较强的抗氧化活性而在食品、药品、化妆品等领域有广阔的应用前景[4]。国内外关于植物中花青素的研究主要集中于提纯、结构鉴定及活性方面的研究[5-7],花青素因分子结构中含有多个酚羟基导致其稳定性相对较差,已有研究表明，由紫薯、蓝莓中提取的花青素在加工及贮藏过程中，易受外界环境因素的影响而导致其色泽改变、活性降低,这制约了花青素的应用及相关产品开发[8-9]。然而,目前国内外有关紫娟茶花青素的研究主要以提取、纯化为主,对于紫娟茶花青素的抗氧化活性的研究则相对较少,而关于其稳定性的研究尚未见详细报道。

为科学利用紫娟茶资源,有必要对紫娟茶花青素的相关研究进行进一步完善,本研究以紫娟茶花青素为研究对象,采用FRAP法、ABTS法和DPPH法测定其抗氧化能力,并以紫娟茶花青素的保存率为考察指标,探讨贮藏条件对其稳定性的影响,从而为紫娟茶花青素的贮藏及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫娟茶鲜叶采自华中农业大学教学茶园品种园的紫娟品种茶1芽4、5叶;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ,纯度≥99%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH,生物试剂)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS,纯度≥98%) 上海源叶生物科技有限公司;浓盐酸分析纯,信阳市化学试剂厂;氯化钾、三氯化铁、硫酸镁、硫酸铜、氯化钙、氯化铝、亚硫酸钠、氢氧化钠、30%过氧化氢、乙酸、乙酸钠、硫酸亚铁、抗坏血酸等分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

SY-360型超声波提取器上海宁商超声仪器有限公司;DELTA-320型pH计梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;UV-2450型紫外可见分光光度计岛津企业管理有限公司;LRH-250A型生化培养箱韶关市泰宏医疗器械有限公司;LPS-1055D型真空冷冻干燥机无锡莱浦仪器设备有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 紫娟茶花青素的制备按蒸青固样法[10]制备紫娟茶干样,磨碎,过40目筛,4 ℃冷藏备用。采用预实验优化出的紫娟茶花青素最佳提取工艺制备花青素,具体步骤为:称取1.0 g茶粉,置于50 mL离心管中,以1∶30的料液比加入含2%盐酸的90%乙醇溶液,将离心管置于超声波提取器中，于60 ℃、功率100 W条件下，浸提40 min后,取出离心管，在4200 r/min离心10 min,取上清液。茶渣进行第二次提取,合并两次上清液,经减压浓缩,-50 ℃冻干,4 ℃贮存备用。

1.2.2 紫娟茶花青素抗氧化活性的测定分别称取一定量的花青素冻干粉及VC,用超纯水溶解,使两溶液浓度均为1 mg/mL,稀释至适当浓度,用于总抗氧化能力及清除ABTS+·和DPPH·的能力。总抗氧化能力的测定参考Benzie等[11]采用的铁离子还原抗氧化剂能力法(FRAP)进行,样品的FRAP值以FeSO4当量浓度(mmol/L)表示;清除ABTS+·能力的测定参考Re等[12]和Thaipong等[13]的测定方法进行,结果以ABTS+·清除率来表示;清除DPPH·能力的测定参考Blois[14]的测定方法进行,结果以DPPH·清除率来表示。

1.2.3 紫娟茶花青素稳定性研究

1.2.3.1 pH对紫娟茶花青素稳定性的影响分别以0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH调节花青素溶液的pH至1.0～12.0,pH用pH计测定,溶液静置1 h后,观察溶液颜色，并于390～710 nm进行光谱扫描。

1.2.3.2 温度对紫娟茶花青素稳定性的影响将花青素溶液分别于4、25、40、60、80、100 ℃水浴恒温保存7 h,每隔1 h取样，用于花青素保存率测定。

1.2.3.3 贮藏时间、光照对紫娟茶花青素稳定性的影响将花青素溶液分别在4 ℃光照/避光、25 ℃光照/避光环境中贮藏21 d,每隔2 d取样，用于花青素保存率测定。

1.2.3.4 H2O2、Na2SO3对紫娟茶花青素稳定性的影响分别向紫娟茶花青素溶液中以1∶9(v∶v)的比例添加浓度为0.05%、0.5%、1%的H2O2溶液;分别向紫娟茶花青素溶液中以1∶9(v∶v)的比例添加浓度为0.05%、0.1%、0.25%的Na2SO3溶液浓度。上述两种方式处理的溶液分别于室温下放置100 min,每隔20 min取样，用于花青素保存率测定。

1.2.3.5 金属离子对紫娟茶花青素稳定性的影响分别向花青素溶液中以1∶9 (v∶v)的比例添加浓度均为0.1 mol/L的Fe3+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Al3+溶液,在放置1 h和6 h时取样，用于花青素保存率测定。

1.2.4 花青素的保存率测定采用单一pH法测定样品溶液花青素含量[15],根据处理前后花青素含量差异计算花青素的保存率[16]。

花青素保存率(%)=处理后花青素含量/初始花青素含量×100

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 紫娟茶花青素的抗氧化活性

由表1结果可知,在一定浓度范围内,紫娟茶花青素的总抗氧化能力、ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力均与花青素浓度呈显著正相关,决定系数分别为0.9991、0.9952和0.9926。当FRAP值为0.5 mmol/L时,所需花青素和VC的浓度分别为0.39和19.30 μg/mL;花青素与VC对ABTS+·和DPPH·清除能力的IC50分别为0.76和0.13,40.82和13.46 μg/mL,表明紫娟茶花青素的抗氧化活性显著强于VC。

表1 紫娟茶花青素的抗氧化活性Table 1 The antioxidant activity of anthocyaninsfrom Zijuan Tea

研究报道，当茶多酚与VC的FRAP值相当时,所需茶多酚的浓度高于VC[17],而当紫娟茶花青素与VC的总抗氧化能力相当时,所需花青素的浓度仅为VC浓度的1/50。当清除50%的ABTS+·和DPPH·时,所需茶多酚浓度分别是VC浓度的2/3、1/2[18],而当清除50%的ABTS+·和DPPH·时,所需紫娟茶花青素的浓度分别仅为VC浓度的1/54、1/90,由此可见,紫娟茶花青素的抗氧化活性比茶多酚强。不仅如此,紫娟茶花青素的抗氧化活性也比报道的蓝莓花青素强,如张杨等[19]研究表明，清除50%的ABTS+·和DPPH·所需蓝莓花青素浓度分别是VC的1/4和1/3。紫娟茶中含有丰富的花青素和茶多酚,按照本方法提取的紫娟茶花青素中不可避免地含有一些茶多酚,紫娟茶花青素具有较强的抗氧化活性，可能是由于其所含的花青素与茶多酚协调作用的结果。

2.2 紫娟茶花青素的稳定性

2.2.1 pH对紫娟茶花青素稳定性的影响由表2可知,pH显著影响紫娟茶花青素溶液的颜色。当pH≤5.0时,溶液以红色为主;pH≥6.0时,溶液开始向绿色转变,且随着pH增大，绿色逐渐加深直至为墨绿色;pH≥7.0时,溶液中开始出现少量沉淀,且随着pH增大，沉淀逐渐增多。

表2 pH对花青素溶液颜色的影响Table 2 Effect of pH on the color of anthocyanins

由图1可知,pH≤6.0时,溶液的吸收光谱基本无明显变化,均于440 nm附近出现最大吸收峰,其中pH1.0时，溶液在530 nm附近出现花青素的特征吸收峰,这证明提取出的溶液为花青素溶液[20];pH≥7.0时,溶液的吸收光谱发生明显变化,440 nm附近的吸收峰消失,490 nm附近出现新的吸收峰。因此,紫娟茶花青素在酸性条件下较稳定。

图1 花青素溶液在不同pH条件下的吸收光谱图Fig.1 Absorption spectra of anthocyanins solution under different pH conditions

2.2.2 温度对紫娟茶花青素稳定性的影响由图2可知,温度越高,紫娟茶花青素的保存率越低,说明温度显著影响紫娟茶花青素的稳定性(p<0.05);在不同温度下保存紫娟茶花青素,其保存率均随保存时间的延长而逐渐降低,且温度越高,降低幅度越大。紫娟茶花青素在不同温度保存7 h后,4和25 ℃下的保存率为97%和84%,而40、60、80和100 ℃下的保存率已分别降至56%、50%、40%和36%。由此可见,紫娟茶花青素的热稳定性较差,应于低温环境中保存。

图2 温度对花青素稳定性的影响Fig.2 Effects of temperature on the stability of anthocyanins注:不同字母表示同一时间不同温度处理的花青素保存率差异显著(p<0.05)。

2.2.3 贮藏时间、光照对紫娟茶花青素稳定性的影响由图3可知,随贮藏时间的延长,紫娟茶花青素的保存率逐渐降低,且贮藏温度越高,其保存率越低。贮藏21 d后,紫娟茶花青素4 ℃时的保存率为70%(光照)、73%(避光),而25 ℃时的保存率仅为33%(光照)、47%(避光)。这表明贮藏时间显著影响紫娟茶花青素的稳定性(p<0.05),紫娟茶花青素不宜长时间放置。

图3 贮藏时间、光照对花青素稳定性的影响Fig.3 Effects of storage time and illumination on the stability of anthocyanins注:不同小写字母表示避光与光照处理的花青素保存率差异显著(p<0.05);不同大写字母表示同一避光或光照条件下不同时间的花青素保存率差异显著(p<0.05)。

光照也明显影响紫娟茶花青素的稳定性。紫娟茶花青素于4 ℃贮藏时,避光与光照条件下贮藏5 d,其保存率差异不显著;但当贮藏7 d及以上时,避光条件下的保存率均显著高于光照条件下的保存率(p<0.05)。紫娟茶花青素于25 ℃贮藏,贮藏1 d及以上时,避光条件下的保存率均显著高于光照条件。上述结果表明，紫娟茶花青素在光照条件下的稳定性较差,应贮藏在低温、避光环境中。

2.2.4 H2O2、Na2SO3对紫娟茶花青素稳定性的影响由图4可知,H2O2和Na2SO3处理均显著影响紫娟茶花青素的保存率(p<0.05);且H2O2和Na2SO3的浓度越大,处理时间越长,紫娟茶花青素的保存率越低,溶液的颜色逐渐变浅。由此可见,氧化剂、还原剂均显著影响紫娟茶花青素的稳定性,故加工、贮藏时应尽量避免其与氧化剂、还原剂接触。

图4 H2O2和Na2SO3对花青素稳定性的影响Fig.4 Effects of H2O2 and Na2SO3on the stability of anthocyanins注:不同字母表示同一时间不同浓度的氧化剂、还原剂处理的花青素保存率差异显著(p<0.05)。

2.2.5 金属离子对紫娟茶花青素稳定性的影响由图5可知,0.1 mol/L的Fe3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Al3+均显著影响紫娟茶花青素的保存率(p<0.05),其中,Fe3+和Cu2+对花青素保存率的影响程度最大,放置1 h的花青素保存率已分别降至37%、44%,放置6 h的花青素保存率则分别降至13%、28%,溶液颜色由深红色分别变为黄绿色、灰绿色,且均伴有絮状沉淀产生。Mg2+、Ca2+和Al3+对花青素保存率的影响程度相对较小,放置1 h的花青素保存率均在84%以上,放置6 h的花青素保存率均在74%以上,溶液颜色均保持为深红色。由此可见,紫娟茶花青素在提取、加工时应尽量使用去离子水,贮藏时应尽量避免与铁质、铜制器皿接触,以防Fe3+、Cu2+等溶出而影响花青素的稳定性。

图5 金属离子对花青素稳定性的影响Fig.5 Effects of metal ions on the stability of anthocyanins注:不同字母a～f表示放置1 h时不同金属离子处理的花青素保存率差异显著(p<0.05),g～l表示放置6 h时不同金属离子处理的花青素保存率差异显著(p<0.05)。