基因组重排技术在微生物育种中的应用研究进展

赵丽红，陈 威，高艳娇，肖 静

(辽宁工业大学土木建筑工程学院，辽宁锦州121001)

微生物资源具有可再生性，其开发利用具有广阔的前景。选育具有优良性状、高产等性能的优良菌株，是开发利用微生物资源的首要任务。然而野生菌株一般很难达到工业生产的要求，所以就需要一定的育种方法对野生菌株进行改良，以得到具有所需优良性状的菌株。目前传统育种技术操作简单，也比较成熟，但是获得目的性状菌株的过程复杂、耗时长、工作量巨大、效率低、盲目性高。现代分子生物学手段虽然取得了一定的发展，但是须要对微生物进行定向的基因操作，技术要求十分高，欠缺基因型和表型相应的背景，不利于广泛推广。基因组重排技术在这样的背景下应运而生。Zhang等在2002年首次提出基因组重排技术，其基本原理是基于原生质体融合技术将多个亲本的全DNA基因组进行重组，从而快速得到具有融合各亲本优良性状的子代。他们成功将该技术用于提高弗氏链霉菌合成泰乐菌素的能力，并取得了显著成果，使弗氏链霉菌合成泰乐菌素的能力得到极大提高［1］。

基因组重排技术是一种在分子定向进化基础上发展而来的新型分子育种技术，它将重组的对象从单个基因扩展到整个基因组，从双亲本扩展到多亲本，从一轮原生质体融合扩展到多轮原生质体融合，因此可以对菌株的目的性状进行更快以及更大范围的优化组合［2］。

1 基因组重排的方法与原理

基因组重排技术主要由构建亲本库、原生质体递归融合、目的表型的筛选3个过程组成。每个过程都有自己的特点和一定的技术手段。Gong等给出了基因组重排技术的操作流程［3］，如图1 所示。

1.1 构建亲本库(parental library)

基因组重排技术的初始菌株应该包含更多的基因型，收集相关菌株以形成亲本库，能为后面的原生质体融合提供可靠的基础。初始菌株的种群多样性和菌株丰富的表型是进行基因组重排技术的第1步。

目前构建亲本库的主要方法还是经典的方法如突变和直接筛选等，其中突变是获得丰富基因型的主要方法，在这个过程中，须要使用化学诱变剂或者物理诱变方式对原始菌株进行诱变处理。如刘源慧分别利用紫外诱变和微波诱变方法对米曲霉(Aspergillus oryzae)FS－16进行诱变，从得到的诱变菌株中选取α－淀粉酶产量较高的突变株与原始菌株FS－16作为亲本，然后进行基因组重排，最后得到α－淀粉酶酶活较高的子代菌株［4］。

构建亲本库时，为了获得丰富的基因型主要是采用组合的方式。筛选菌株的主要方法根据目的表型，比如产量和环境耐受性等。可是菌株的生长性状也应该被给予足够的重视，因为拥有较高产量和环境耐受性菌株的生长性状可能会受到损害。因此，构建亲本库时应采集野生菌株，以促进复杂子代的生长特性。其次，通过合理的方式获得的菌株也可以作为基因组重排的出发菌株。应用合理的筛选方法可以扩大亲本菌株的筛选范围，从而能增大经过基因组重排技术处理后获得目的表型的概率。

1.2 原生质体的递归融合(recursive protoplast fusion)

基因组重排是基于原生质体融合技术(protoplast fusion)的育种技术。原生质体的多轮递归融合使细胞之间的基因转移频率大大增加。在原生质体的递归融合过程中，来自亲本的原生质体经历混合(mix)、融合(fusion)、再生(regeneration)等过程。然后从再生的原生质体中选出性状优良的菌株，作为下一轮原生质体融合的出发菌株。同时亲本菌株基因的多样性在原生质体递归融合的操作下能够被扩充到子代中，这样有利于得到目的表型。

经典的基因组重排技术主要依赖于PEG(聚乙二醇)诱导原生质体融合，但PEG诱导存在效率低、重组菌不稳定、易退化、须制备双亲本原生质体等缺点，这极大阻碍了基因组重排技术在微生物中的育种应用。目前，使用化学药剂和电脉冲法诱导原生质体融合是主要的方法。Skelley等在细胞融合前利用微流体装置对细胞进行排列，这很大程度上提高了原生质体融合的效率［5］，同时原生质体的再生率也是基因组重排取得成功的关键。Imada等研究表明，原生质体的再生率在液体再生培养基中优于固体平板［6］。

1.3 目的表型的筛选(selectionofdesiredphenotype)

确保基因组重排技术成功的重要步骤是目的表型的筛选。尽管可以在特定的培养基上培养子代以获得特定的抗性菌株，但是过量代谢产物的产生一直以来都被认为是进行表型筛选的难点。传统筛选改良菌株的方式取决于菌株的生理生化特性，如在琼脂平板上的水解圈、透明圈和抑菌圈等。John等利用乳酸融合菌能够直接水解淀粉这一特性，根据乳酸融合菌水解淀粉产生的透明圈的大小筛选出了高产乳酸融合菌［7］。另外，利用遗传标记的方法也可以筛选融合菌株。Dai等利用菌体营养缺陷型的遗传标记成功标记了革兰氏阴性细菌的目的融合子［8］。

通过灭活原生质体筛选融合子的方法也有一定应用，原生质体通过加热或紫外线照射最终达到灭活的目的。理论上，一种特定的灭活方式可能在染色体的同一位点带来损害，如果几个亲本原生质体采用同样的方法灭活，将会给融合子再生带来困难;但是染色体上不同位点的损伤却可以得到互补修复，所以一般需要采用不同灭活方式提高融合子再生率。Kang等分别采用紫外线和热灭活的方式处理亲本原生质体，最终筛选出理想的表型融合子［9］。近年来，高通量的筛选方法得到了很快发展，如荧光激活细胞分选技术、液相色谱质谱法等，这些新技术使融合子的筛选效率得到了显著提高。

2 基因组重排技术的优势

传统育种方法曾发挥着很大的作用，但缺点是工程量巨大、耗时长且难以获取复杂表型［10－12］。作为新兴的育种技术，基因组重排在微生物育种方面拥有许多传统育种技术所无法比拟的优势。

2.1 基因组重排技术是多亲本基因水平上的转移

基因组重排技术能够实现多亲本基因水平上的转移。利用原生质体融合技术的优点，以实现多亲本、远源亲本间的基因组转移、重排，很大程度上增加了多重优良性状在子代出现的概率。如Yamashita等通过灰色链霉菌和天神岛链霉菌种间基因组重排，筛选到1株重组子菌株，此菌株可产生抗生素吲哚佐霉素(indolizomycin)［13］。王航等将筛选到的链霉素抗性菌株(Str－70)与庆大霉素抗性菌株(Gen－139)作为出发菌株进行多轮基因组重排，最终得到的菌株(SG4－34)同时具有2种抗性且多杀菌素产量与原始菌株相比提高6倍［14］。

2.2 基因组重排技术避免菌株产生“疲劳效应”

传统诱变育种技术由于长期使用诱变剂，菌株自身抗性会得到增强，最终造成菌株产生“疲劳效应”。基因组重排是利用原生质体递归融合技术来改良的菌株，整个过程只有1次诱变，所以避免产生“疲劳效应”等现象。

2.3 基因组重排技术快速高效

传统诱变育种是对单一原始菌株用传统的诱变方法进行诱变，以得到有利的突变性状，过程繁琐、时间漫长且存在较大的盲目性。基因组重排技术获得正突变菌株只须1次诱变，然后利用原生质体递推式融合技术改良菌株，这个过程涉及多亲本全基因组范围的遗传信息交换，获得正突变性状的速度大大提高，同时也更加高效。如Zhang等发现，对菌株进行2轮基因组重排所达到的成果，相当于传统诱变育种需要20 年才能完成［1］。

2.4 基因组重排技术简化了育种过程

通过定向进化工程、DNA重组技术、生物学和代谢工程手段等，虽然也可以获得理想的优良性状，从而实现定向进化，但是这些技术须要巨大的人力物力去了解目标菌株的遗传背景与规律。基因组重排技术的对象是亲本的全基因组，进行随机交换重组，并筛选出带有目的性状的优良菌株，这个过程不用了解微生物的遗传背景，省去了大量繁重的工作，极大地提高了育种速率与效率。

3 基因组重排技术的应用

基因组重排技术经过十几年的发展充分融合了细胞工程和诱变育种的特点，在微生物育种以及获得代谢产物等方面体现出了很明显的优势。而且基因组重排技术在提高菌株代谢产物产率、增强菌株耐受性、提高底物利用率和范围以及改造微生物的代谢途径等方面均取得了较大的发展。

3.1 提高产物产率

基因组重排技术可以快速得到带有目的表型的菌株，同时可以有效地优化、调节多基因控制的性状，以提高菌株的产量。目前，在提高代谢产物产率方面已经有了许多成功的应用。

El－Gendy等以诺卡氏菌阿莱2000菌株为原始菌株，通过基因组重排技术筛选出绫霉素产量很高的目的菌株。首先通过传统的诱变技术在原始菌株的基础上得到改良菌株，在改良菌株的基础上又进行基因组重排，并以绫霉素产量作为筛选指标，通过3轮基因组重排后最终得到目的菌株，目的菌株的绫霉素产量是原始菌株的19倍，是改良菌株的1.9倍［15］。Zheng等利用浓缩的高效液相色谱法筛选出产生丁二酸浓度较高的菌株，然后将所筛选的菌株作为初始菌株，经过3轮基因组重排，得到子代菌株丁二酸的产量比亲本菌株提高约73%［16］。Chalopagorn等利用基因组重排技术提高嗜热芽孢杆菌属的脂肪酶产量，将芽孢杆菌属CF03菌株经过紫外线照射和甲磺酸乙酯(EMS)诱变，以所获得的诱变菌株为初始菌株，经过2轮基因组重排，得到融合菌株(FB1)，与野生型菌株相比，FB1菌株的生长率和脂肪酶的产量最高分别增加了150%和238%［17］。表1总结了基因组重排技术在提高产物产率方面的应用。

表1 基因组重排技术在提高产物产率方面的应用

3.2 增强菌株对环境的耐受性

目前，基因组重排技术在增强菌株对酸、盐、产物、底物、溶解氧、副产物及温度等因素的耐受性方面已有很多成功的应用。Patnaik等利用基因组重排技术筛选出了耐酸性更强的乳酸菌菌株［30］。Dai等利用基因组重组技术成功得到了能耐受8 mmol/L五氯苯酚(PCP)的融合子，并且此融合子能够在48 h内完全降解3 mmol/L PCP［31］。2008年王立梅等利用基因组重组技术得到了能够在pH值为3.6的环境下生长且L－乳酸产量达到5.67 g/L，发酵温度达到40℃的菌株［32］。Cao等以异常汉逊酵母菌株作为原始菌株，通过3轮基因组重排得到目的菌株，其具有很高的耐盐性能和pH值生长范围［33］。Zheng等以来自原始菌株酿酒酵母的紫外线突变体为出发菌株，经过2轮基因组重排得到重组菌株YZ2，此重组菌株在乙酸压力下显示出更快生长速度和细胞生存能力［34］。Zheng等在谷氨酸棒状杆菌原始菌株的基础上经过紫外线照射和耐高温等传统诱变技术手段筛选出5株菌株，将此5株菌株又通过3轮基因组重排技术得到1株目的菌株，经过试验与分析，目的菌株的L－谷氨酸的产量比原始菌株产量提高了1.8倍，耐热性也得到了一定的提高［35］。黄俊等采用基因组重排技术有效而快速地获得了在产乙醇能力和乙醇耐受力方面都更好的里氏木霉菌株［36］。Li等通过连续4轮基因组重排，获得丙酮丁醇梭菌的融合菌株，融合菌株在耐热性、溶剂耐受性及环境稳定性方面比野生菌均有进一步提高［37］。

3.3 提高底物利用率及其范围

微生物对底物的利用率和范围是菌株非常重要的目的表型，基因组重排技术在提高微生物底物利用率及范围方面也有着重要的成果。如John等以德氏乳酸杆菌和产淀粉酶的枯草芽孢杆菌为亲本菌株，利用基因组重排技术，筛选到了能直接转化淀粉为乳酸的子代菌株［7］。Zhao等将轮枝霉(Diasporangium sp.)和黑曲霉作为亲本菌株，利用基因组重排技术得到的新菌株可以利用全部8种碳源，而亲本仅仅能利用 4种碳源［38］。Kang等把出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)N3.387作为基因组重排的出发菌株，通过基因组重排后获得融合菌株F3－2，相比于野生菌株，融合菌株对底物的利用率提高了29.0%［39］。Zhou等利用基因组重排技术，从链霉菌中筛选出不仅ε－聚赖氨酸产量高，且对产物ε－聚赖氨酸具有一定抗性的融合菌株［40］。

3.4 改造微生物的代谢途径

在基因组重排技术中随着整个基因组片段的重排，可以使细胞表型得到快速改进，细胞的代谢途径也可以得到一定的优化。基因组重排能够激活菌株内部某些沉默基因而获得新的代谢产物。如Wang等在利用基因组重排技术提高瘤座霉属(Tubercularia sp.TF5)菌株的紫杉醇产量试验中，在子代融合子的代谢产物中发现了8种新结构的物质。这些物质与直接亲本和原始菌株所产的同类物质结构均不同，这说明子代融合子所产生的新物质是基因组重排后某些沉默基因被激活 表 达 造 成 的［41］。Cao 等 对 鲁 氏 接 合 酵 母(Zygosaccharomyces rouxii)进行3轮基因组重排后获得1株融合菌株，其能产生亲本菌株无法产生的新的化合物［42］。

4 展望

基因组重排技术的研究对象为微生物细胞内整套基因组，不须要探究菌株的遗传背景，利用多轮循环式基因组重排筛选，将多个优良性状集中到子代目的菌株中，这是传统育种技术、原生质体融合技术和DNA重排技术所不具有的独特优势，是微生物育种技术中的具有里程碑式意义的进步。正突变基因库的建立是基因组重排技术中关键一步，其多样性以及与目的性状的相关性直接关系到重排能否成功，所以正突变基因库的构建方面还需要更多的探索。传统的化学融合、电融合等融合效率较低，新兴的融合技术如微流体技术、激光诱导技术等虽然融合效率较高，但是使用范围较窄，所以可能还须要进一步探索新的原生质体融合技术。在融合子的筛选方面，目前常用的方式是热灭活与紫外灭活标记，这2种方式会对原生质体带来一定的生理损伤，影响融合效率，因此还须要高通量的筛选方法来保证基因重排技术的进一步发展。目前，尽管基因组重排技术在克服不同亲本细胞重组成功率较低问题，以及高效筛选融合菌株等方面还存在一定程度的挑战，但是随着基因组重排技术与其他生物技术如代谢工程、基因组学等相结合以及多种高通量、高效率筛选策略的出现，基因组重排技术将会有更快的发展和更广阔的应用。