盐胁迫下陆地棉耐盐相关WRKY基因的表达分析

蔡继鸿，徐 鹏，张香桂，郭 琪，徐珍珍，沈新莲

(1.南京农业大学，江苏南京210095;2.江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花油菜重点实验室，江苏南京210014)

为适应不良生长环境，植物在长期的进化过程中形成了一系列复杂而有效的应对机制。现有的研究表明，这种由于自身进化而获得的应对机制主要是通过转录激活或转录抑制相关基因的表达发生作用的。而在这一过程中，转录因子发挥重要作用，通过与其他相关蛋白或自身之间的相互作用激活或抑制相关靶基因的表达。近年来，研究显示WRKY转录因子家族中众多成员都参与植物的非生物胁迫响应机制［1］，目前已经成为植物抗性功能研究中的一个热点。

WRKY转录因子作为一个重要的转录因子超家族，除了参与植物的生长发育、物质代谢途径及在抗病毒、细菌等方面发挥重要的调节作用外，还参与应答环境信号刺激，如低温、高盐、干旱等非生物胁迫逆境［2］。近年来，由于盐碱化对我国农业的影响，植物耐盐机制的研究已成为热点。目前很多研究都表明WRKY参与植物对盐胁迫的响应。在前期的研究中，基于盐胁迫下旱地棉转录组测序，共鉴定了28个受盐胁迫诱导的WRKY基因［3］。本研究对耐盐陆地棉品种K368和盐敏感品种苏棉12号的28个耐盐相关WRKY基因进行表达分析，为棉花耐盐机制的研究提供有力的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为陆地棉品种K368和苏棉12号(简称:苏12)。将种子播于盆钵中，待长至2叶1心时开始盐处理，将小苗浸在含 200 mmol/L NaCl(其中 Na+∶Ca2+浓度比为15 ∶1)的营养液中，分别处理 0、6、24、72 h，取不同时期的根液氮速冻后于－70℃保存备用。

1.2 耐盐鉴定

耐盐鉴定试验于2006年12月在江苏省农业科学院经济作物研究所培养室进行。将预发芽的K368和苏12种子播于土质盆砵中，将盆砵放于28℃光照培养箱中培养，待长至2叶1心时开始盐处理，盐处理浓度为350 mmol/L。处理当天取10株幼苗作为对照，测定相关指标，包括植株高度、地上部生长量等。处理7 d后测定盐胁迫下和清水对照的10株植株相关指标，计算植株相对高度、地上部相对生长量等。性状相对值为胁迫环境下某性状表型值与对照环境下某性状表型值的比率，计算公式:某性状相对值=某一性状盐胁迫时表型值/对照环境表型值。

1.3 实时荧光定量PCR

不同盐处理时期根样RNA提取参照文献［4］。以反转录获得的cDNA为实时荧光定量PCR的模板，以棉花的Actin作为内参基因，根据WRKY基因的非保守区设计特异性引物，对WRKY基因进行荧光定量PCR扩增，检测基因受盐胁迫诱导时的表达情况。实时荧光定量PCR分析方法参照文献［3］，数据分析通过 2－ΔΔCT公式计算基因的相对表达量［5］。

1.4 数据统计

采用Excel 2010进行数据处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下K368和苏12表型比较

由图1可知，与对照相比，经350 mmol/L盐处理7 d后，K368和苏12均出现明显的盐害胁迫症状，生长均受到明显抑制。与K368相比，苏12在生长上受到的抑制更明显。盐处理7 d后测定相关指标来评价2个品种的耐盐性，包括植株相对高度、相对地上部鲜质量和相对地上部干质量等。由表1可知，K368和苏12相对株高、相对地上部鲜质量、相对地上部干质量差异极显著。因此，认为K368相对于苏12表现出更好的耐盐性。

2.2 盐胁迫下耐盐相关WRKY基因在耐盐品种K368和盐敏感品种苏12根部的表达分析

表1 盐胁迫下K368和苏棉12号表型比较

利用实时荧光定量PCR对耐盐品种K368的28个耐盐相关WRKY基因进行表达分析，由图2可知，较之对照(盐处理0 h)，27个WRKY基因在盐处理不同时期(6、24、72 h)诱导表达中仅WRKY22表达差异不显著。大部分耐盐相关WRKY基因随着盐处理时间延长，其相对表达量表现为逐步上升的趋势，且大部分WRKY基因在盐处理24 h后其相对表达量达到最高，其中WRKY5、WRKY6以及WRKY38在盐处理24 h后其相对表达量上调300倍以上;仅WRKY107随着盐处理时间延长，其相对表达量表现为逐步下调趋势。

本研究同样对盐敏感品种苏12的28个WRKY基因进行了表达分析，由图3可知，25个WRKY基因盐胁迫诱导表达中仅WRKY9、WRKY75、WRKY105表达差异不显著。大部分WRKY基因盐胁迫后其相对表达量表现为上调表达，其中WRKY31在盐处理24 h后上调表达800倍以上;仅WRKY22、WRKY52、WRKY90盐处理后表现为下调表达。

2.3 耐盐相关WRKY基因在K368和苏12中差异表达分析

本研究分别对28个WRKY基因在耐盐品种K368和盐敏感品种苏12中进行了差异表达分析，其中22个WRKY基因在品种间表达趋势表现一致，即盐处理后WRKY基因在K368和苏12较之对照均表现为上调表达或下调表达，仅仅在表达量上存在差异。其中12个WRKY基因在耐盐品种K368中相对表达量更高，如WRKY6在耐盐品种K368中盐处理24 h后其相对表达量达到了300倍以上，在盐敏感品种苏12中，其相对表达量在盐处理72 h后最高，与对照相比较，其表达量仅上调了6倍。5个WRKY基因在盐敏感品种苏12中相对表达量更高，如WRKY43在苏12中其相对表达量在盐处理24 h达到约600倍，而在耐盐品种K368中，其相对表达量在盐处理24 h后仅上调了不到10倍。5个WRKY基因在K368和苏12中表达量相当，无明显差异。此外，有6个WRKY基因在K368和苏12中表达不一致，WRKY52、WRKY90盐处理后在K368中表现为上调表达，而在苏12中则表现为下调表达;WRKY9、WRKY75、WRKY105盐处理后在K368中表现为上调表达，而在苏12中差异表达不显著;WRKY22盐处理后在苏12中表现下调表达，而在K368中差异表达不显著。综上所述，盐胁迫后总共有23个WRKY基因在耐盐品种K368和盐敏感品种苏12中差异表达，仅 WRKY5、WRKY27、WRKY28、WRKY51 及WRKY104无明显差异。推测该23个WRKY基因可能与陆地棉耐盐性有一定的关联。

3 讨论与结论

许多研究已报道了WRKY基因可能参与盐胁迫诱导表达，在植物中过量表达一些WRKY基因能够改良植物的耐盐能力。在拟南芥中，35个WRKY基因中有18个基因被盐胁迫诱导表达，过量表达WRKY25、WRKY33可明显提高拟南芥的耐盐性［6］。Qiu等研究发现，水稻的13个WRKY基因中有9个应答NaCl处理，过量表达OsWRKY45可提高拟南芥的耐盐性［7］。大豆中64个WRKY转录因子中的22个在盐胁迫下差异表达，过量表达大豆GmWRKY54可提高拟南芥的耐盐性［8］。过量表达玉米ZmWRKY33可改善拟南芥的耐盐性［9］。这些都说明WRKY转录因子家族成员是响应盐胁迫反应的重要调控因子。本研究在前期研究的基础上继续对受盐胁迫诱导的28个WRKY基因在陆地棉中进行表达分析，大部分WRKY基因均表现为不同程度的诱导表达，推测可能与陆地棉耐盐特性有一定关联性，但是表达强度的差异是否影响到基因功能，对此还需要进一步研究。

目前，棉花中已经有很多关于WRKY响应盐胁迫反应报道。Shi等从陆地棉中分离出GhWRKY39，该基因被病原菌以及盐胁迫诱导，在拟南芥中过量表达该基因能够提高其耐盐性［10］。Zhou等从陆地棉中鉴定了26个WRKY基因，在NaCl诱导下其中的5个基因在根中上调表达［11］。Cai等在全基因组范围内分析雷蒙德氏棉WRKY基因家族，同时也在陆地棉中分析了这些基因在非生物胁迫下的表达情况［12－13］。所有这些结果表明WRKY基因参与了棉花对盐胁迫网络调控的应答。