铅对小鼠肝脏线粒体5种标志酶活力的影响

刘刚， 杜悠雯， 张璐， 刘晓颖

(安徽医科大学 生命科学学院， 合肥 230032)

线粒体是真核生物进行有氧呼吸的主要部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化并释放能量的场所，线粒体正常生理生化功能的行使离不开线粒体中的各种酶[1]。在线粒体中，一些具有代表性的酶对线粒体正常功能的实现起到关键作用，这些酶不仅能够维持线粒体的正常形态、结构，还与细胞呼吸作用及ATP的合成密切相关[2-4]。线粒体酶在细胞生理生化过程中发挥着非常关键的作用，其结构和功能的正常与否对细胞、组织乃至整个机体正常功能的维持具有相当重要的作用[5-6]。

线粒体是细胞对外来物质反应最敏感、最早出现损伤的细胞器，研究表明，线粒体是许多环境毒物尤其重金属作用的优先靶标[7-9]。近年来，随着现代工、农业的发展，越来越多的重金属被排放到环境中，重金属能够影响与线粒体电子传递和氧化呼吸作用密切相关的酶，通过改变酶的结构，或与起辅酶作用的金属发生置换反应，致使其活性减弱甚至丧失，进而导致影响氧化磷酸化效率及ATP的合成效率，导致细胞凋亡或者坏死[10]。研究表明在重金属钼的作用下，小鼠肝脏线粒体中的SDH酶活性受到明显抑制，且随着钼浓度的增加酶的活性逐渐减弱[10-11]。镉对华溪蟹线粒体中的SDH、NADH氧化酶活力均随着浓度的增加先升后降[11]。高浓度镉短期暴露能够降低黄颡鱼鳃线粒体ATP酶的活性，铅离子能够使家蚕幼虫脂肪体中的GST酶与GSH-PX酶的活性显著升高，染镉后大鼠线粒体内的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力明显下降，进一步加剧膜结构和功能的损伤[12]。

铅是一种古老的工业毒物和环境污染物，使用普遍且不可降解，工业生产排放的铅以各种形式在环境中不断积累与放大，造成低浓度、长时间、持续的污染，对各种生物产生毒害作用，给生态环境和人类健康带来巨大的危害。随着现代工农业的发展，越来越多的铅被排放到环境中，铅污染已经成为严峻的公共卫生问题[13]。肝脏比其他组织器官对Pb2+更敏感，Pb2+侵入机体后使肝细胞中的线粒体及其蛋白质的形态结构和生理生化功能产生不可逆转的伤害，引起线粒体内部稳态的破坏，造成相关线粒体蛋白的表达异常，影响到线粒体的生理功能，导致或促进细胞损伤的发生[13-14]。近年来，重金属对线粒体及其蛋白质毒性作用机制的研究虽然取得一些进展，但还存在许多有待解决的问题。本研究拟以重金属铅胁迫下的小鼠肝脏线粒体酶为研究对象，探究不同浓度Pb2+胁迫下线粒体酶活性特点，旨在全面评价重金属对线粒体酶的毒性效应，揭示重金属对线粒体的损伤机制，以期为重金属污染的预防与治疗提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物与处理

供试小鼠为成年健康昆明种小鼠，由安徽医科大学实验动物中心(安徽省实验动物中心)提供，雌雄各半，个体质量为22.00 g±3.00 g，在温度为20℃～25℃的条件下观察饲养1周。按SAS随机分组程序将35只小鼠随机分为7组(每组5只)，分别为对照组、50、100、200、300、400和500 mg/kg硫酸铅染毒组。染毒组分别经口灌胃相应浓度的硫酸铅溶液，对照组经口灌胃给予相应体积的高纯水，共给药30 d。实验过程中每只小鼠单笼饲养，各组饲养管理条件相同，实验期间密切观察各组小鼠的情况，给药30 d后脱臼处死小鼠。

1.2 线粒体提取

处死的小鼠迅速剖开腹腔取出肝脏，浸入预冷的冲洗液(0.01 mol/L PBS pH 7.4，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF)中冲洗，轻轻用滤纸吸干后转至冰上烧杯；参照细胞线粒体分离试剂盒提取、纯化各实验组小鼠肝脏线粒体，液氮冻存备用。

1.3 酶活性测定

在线粒体沉淀物中加500 μL匀浆液，混匀后按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒操作方法分别测定SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX等5种酶的活性。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 实验期间小鼠的症状

实验结果显示，较低浓度的铅离子实验组(50和100 mg/kg)和阴性对照组(0 mg/kg)小鼠在实验期间无明显异常现象，精神状态和食欲没有受到明显的影响；中浓度实验组(200、300 mg/kg)小鼠在一周后出现轻微的食欲下降；而高浓度实验组(400、500 mg/kg)小鼠在一周后出现明显的食欲下降，精神沉郁。小鼠剖检观察组织器官显示，低铅组小鼠与对照组相似，无明显症状；而高铅组小鼠肝脏呈现明显的暗红色，且体积增大。

2.2 铅对小鼠肝脏线粒体5种酶活力的影响

经Pb2+暴露处理后，小鼠肝脏线粒体的SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX等5种酶的活力均呈下降趋势。在各染毒组中，50 mg/kg染毒组与对照组相比，5种酶的活性略低于对照组，分别下降了14.64%、15.90%、17.87%、11.87%和16.48%，其中下降率最高的为GST(17.87%)，最低的为ATP酶(14.64%)。而浓度最高的500 mg/kg染毒组，与对照组相比，各组酶的活性分别下降了74.59%、71.49%、60.00%、50.65%和70.68%。实验结果显示，随着Pb2+浓度的增加，小鼠肝脏线粒体5种酶的活性都呈现下降趋势，在500 mg/kg染毒组，酶活性下降至最低点，较对照组差异极显著(P<0.01)，具体见表1和图1。

通过生物统计学分析发现，SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX 5种酶的活力随着铅离子胁迫浓度的增加均呈逐渐下降趋势。各实验组酶活性与铅离子浓度呈明显负相关性，随着铅离子浓度的增加，各酶的活性逐渐下降(图2)。

图1 不同浓度Pb2+胁迫下小鼠肝脏SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX 等5种酶活性分析

图2 Pb2+浓度与小鼠肝脏SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX 等5种酶活性相关性分析

3 讨论

铅是环境中广泛存在的重金属污染物之一，环境中暴露的铅一旦进入机体后可与蛋白质或酶分子中许多基团结合，破坏其结构，从而影响体内酶的生物活性，引起一系列生理生化的异常，严重影响机体的功能[15]。Pb2+可以与线粒体呼吸链上的酶蛋白相结合，影响线粒体内膜系统的质子泵功能，阻断线粒体氧化磷酸化，影响能量的生成；同时，Pb2+也能破坏细胞内过氧化与抗氧化系统的平衡，导致细胞的凋亡或引起组织、器官的病变[7-9, 16-17]。Pb2+对生物体有很强的毒性，其能损害多种组织和器官。实验研究表明醋酸铅对小鼠的LD50为10 562 mg/kg，持续、低浓度的铅暴露不会导致小鼠死亡，小鼠体质量随醋酸铅剂量的增加变化不明显，但对小鼠大脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏均具有一定的急性毒性效应，且小鼠病理组织变化明显，故本研究染毒组最高浓度为500 mg/kg。本实验通过生物统计学分析发现，各实验组SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX的酶活性与铅离子浓度呈负相关性，随着铅离子浓度的增加，5种酶的活性逐渐下降，与重金属镉胁迫下的水生生物酶活性相比，略有差异[18, 22]。

作为新陈代谢最旺盛的器官，肝脏细胞中线粒体所占的比例较大，NADH和SDH与线粒体电子传递链密切相关，可以反映出有氧呼吸的强弱，间接体现线粒体结构和功能的变化，是线粒体呼吸链的标志酶。NADH是呼吸链中的第一个质子泵，推动H+跨过线粒体内膜到线粒体基质与细胞溶胶相接触，由此而形成的电化学梯度即质子动力驱动ATP合酶合成ATP，促进氧化磷酸化反应的实现[18]。SDH可以将柠檬酸循环中的琥珀酸氧化为延胡索酸，是细胞有氧呼吸-柠檬酸循环的关键酶[19-20]。ATP酶又称为三磷酸腺苷酶，是一类能将三磷酸腺苷(ATP)催化水解为二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根离子(Pi)的酶，在该生化反应中释放出大量的能量。在本实验中，随着Pb2+浓度的增加，导致线粒体内与有氧呼吸有关的酶的结构发生了变化，导致其活性降低，电子传递受阻，氧化磷酸化合成出现障碍，最终导致能量代谢的衰竭。

表1 不同Pb2+浓度下小鼠肝脏SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX 5种酶活性值

谷胱甘肽S-转移酶(GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)是生物体内重要的解毒酶。GST酶是重要的解毒酶系之一，能利用还原性谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的还原作用参与解毒反应和修复细胞的氧化损伤，GSH-PX在细胞内能消除有害过氧化代谢产物，保持细胞内自由基的平衡，具有保护细胞生物膜结构和功能的作用[21-22]。从本实验结果可以看出，当Pb2+剂量达到一定量时能显著降低小鼠肝脏线粒体GST和GSH-PX活力，当Pb2+浓度升高至500 mg/kg时，两种酶的活性降到最低，与对照组相比出现极显著差异(表1和图1)。

本实验研究表明，重金属铅暴露能导致小鼠肝脏组织线粒体SDH、NADH、ATP、GST和GSH-PX 5种酶活性的降低，这为今后进一步探讨重金属暴露对肝脏线粒体标志酶毒性影响的确切机制提供了一定的理论依据。至于铅降低小鼠肝脏线粒体酶活力的机制，还有待于进一步探讨。