羊结肠小袋纤毛虫病的诊断与防治

2018-10-15宋开放崔琳琳翟焕杰邵立圣杨树宇姜金庆刘俊伟

中国兽医杂志 2018年6期

周叶，宋开放，崔琳琳，翟焕杰，邵立圣，杨树宇，姜金庆，刘俊伟

(河南科技学院动物科技学院，河南新乡453003)

羊结肠小袋纤毛虫病是由纤毛虫纲、毛口目、小袋虫科、小袋虫属的结肠小袋纤毛虫寄生于羊的大肠内所引起的以腹泻、脱水、消瘦和贫血为特征的人兽共患原虫病。引起羊腹泻的疾病，临床常见的有球虫病、鞭虫病、羔羊痢疾、大肠杆菌病、沙门菌病、食道口线虫病、夏伯特线虫病、食盐中毒、隐孢子虫病、副结核病等[1-2]，但关于羊结肠小袋纤毛虫病引起的腹泻尚未见报道。笔者在兽医临床诊疗过程中，通过对疑似羊结肠小袋纤毛虫病的病羊进行临床检查，粪便实验室检验，粪便水洗沉淀物染色镜检，药物敏感性试验，诊断为羊结肠小袋纤毛虫病，并用甲硝唑、中药驱虫净散等进行了防治试验，有效控制了该病，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物试验羊来自新乡市某杜泊绵羊养殖户，饲养规模100只，放牧散养，其中30只患严重腹泻疾病。

1.2 试剂与药品可溶性淀粉培养基、蒸馏水、生理盐水、二甲苯、0.4%氢氧化钠溶液、2%碘液、美蓝染色液、甲醇、2.5%戊二醛、福尔马林、甲硝唑片等，由河南科技学院临床兽医学教研室提供；中药驱虫净散的原材料，购自新乡市医药公司，并按文献3的方法进行制备。

1.3 临床检查采用问诊、视诊等临床基本检查方法对发病羊群进行检查，调查羊场的病史和临床发病症状。

1.4 粪便采集采集粪便时，术者依次戴上医用乳胶手套和PVC手套，直接用手指从直肠内掏取粪便，再将PVC手套翻转脱下，羊粪即被包含其中，也可将采集到的羊粪放入洁净塑料袋中，编号登记后备用。如不能及时送检，可称取粪便10 g，加入90 mL 2.5%戊二醛或5%～10%福尔马林中固定后送检。

1.5 粪便直接压片法检查取一片洁净的载玻片，在玻片中央滴加1～2滴生理盐水(冬季需加温)，然后用镊子挑取少量粪便，与蒸馏水混匀，并将粗粪渣推向一边，涂布均匀，作成涂片，涂片的厚薄以放到书上隐约可见下面的字迹为宜，加上盖玻片，置显微镜下检查。粪便采集后应注意保温，并及时送检，冬季可放置28 ℃培养后再进行观察，防止羊结肠小袋纤毛虫滋养体运动性丧失或胞膜破裂。

1.6 粪便水洗沉淀物染色镜检取4个1.5 mL离心管，加入羊结肠粪便混悬液各1 mL，1 500 r/min离心2 min，弃去上清液，分别加入美蓝染色液，2%碘液，苏木素染色液，瑞氏染色液各1 mL，震荡混匀，置室温染色，定期观察染色效果，染色完毕，1 500 r/min离心2 min，弃去染色液，用蒸馏水离心洗涤3次，终止染色，必要时用1%盐酸乙醇或蒸馏水分化，再用60%、70%、80%、90%、100%乙醇(2%碘液组脱水后，还需经2%碘无水乙醇复染)，逐级脱水，每级脱水15 min，之后离心弃去上清液，沉淀加入二甲苯1 mL，震荡混匀，透明30 min，离心后，用加样器吸取0.7 mL二甲苯，震荡混匀，吸取悬液10 μL，均匀涂于载玻片中部，待二甲苯将干未干之际滴1滴中性胶，用眼科镊子夹一洗净擦干的盖玻片，使盖玻片一端衔接处中性胶后轻轻放下，中性胶即平铺于盖玻片之下，之后玻片于60 ℃干燥箱中烘干，置显微镜下观察。

1.7 药物敏感性试验首先用可溶性淀粉培养结肠纤毛虫：复方氯化钠注射液500 mL，无菌操作加入标准胎牛血清25 mL，震荡混匀，置用4 ℃冰箱备用，用时每8 mL加入灭菌可溶性淀粉一铂耳，进行前述粪便中结肠小袋纤毛虫人工培养[4]。

然后，在96孔细胞培养板加入可溶性淀粉培养基50 μL/孔，至第12孔；每孔分别加入羊结肠小袋纤毛虫悬液50 μL，轻轻震荡细胞培养板，使各孔混匀，置28 ℃培养12 h，置倒置显微镜下观察羊结肠小袋纤毛虫滋养体的存活情况。将丙硫苯咪唑，盐酸左旋咪唑，甲硝唑，痢特灵，乳酶生，土霉素片，复方新诺明，血虫净、氨苄青霉素钠和中药驱虫净散制备成100 mg/mL混悬液或溶液，在前述细胞培养板中分别加入倍比稀释的药品溶液100 μL，观察小袋纤毛虫滋养体的存活情况。

1.8 药物防治试验将羊场患严重腹泻的30只羊，根据发病情况平均划分为甲、乙两组，每组15只。甲组病羊用甲硝唑10 mg/kg体重，经口灌服，2次/d，连用3 d。乙组病羊用中药驱虫净散治疗，体重在50 kg以上的羊投50 g/次，体重在50 kg以下的羊25 g/次，开水冲，候温一次灌服，1次/d，连用7 d。同时，重症病羊配合补液，补糖，补充钙、磷和氨基酸，配合抗菌、止泻、解毒、强心、健胃等对症治疗措施。

2 结果与分析

2.1 临床检查结果笔者走访发现，该绵羊养殖户采用圈养结合放牧的饲养方式，放牧时采食路边、河边的杂草和落叶，补饲花生秧、玉米、豆腐渣等饲料，圈舍是靠墙搭建的水泥瓦棚，粪尿清理不及时，有刺鼻氨气味，户主曾使用伊维菌素驱虫。本次共30只羊发病，发病率为30%，典型症状与其他动物结肠小袋纤毛虫病一致[5-7]。严重者多见于3～4月龄羔羊，可见病羊精神沉郁，体温39.5 ℃～40.5 ℃，食欲减退或废绝，饮欲增加，眼球下陷，皮肤弹性下降，起初排出软粪，很快变为糊状稀粪，甚至呈水样，带有黏液，气味腥臭，后躯及尾部被稀粪污染。慢性病例多见于产后母羊，病羊精神不振，四肢无力，喜欢卧地，食欲减退，异嗜，食欲废绝，体温正常或低下，病羊日渐消瘦，皮下脂肪减少，绵羊尾脂急剧减少，被毛粗乱，黏膜淡白或苍白，粪便含水量增加，排团状或条状软粪，呈粒状、团状或泥状。

2.2 粪便直接压片法镜检结果病羊新鲜粪便直接压片镜检时，由于滋养体不断运动，观察和拍摄相对困难，可在虫体运动缓慢时用快门进行连续拍摄，结果见图1。羊结肠小袋纤毛虫滋养体呈梨形、纺锤形、卵圆形或圆形，灰黄或灰黑色，前端稍尖，中部最宽，后端稍圆。滋养体全身密生纤毛，纤毛摆动时呈规律的波浪状，使滋养体迅速前进，旋转。伸缩泡无色透明，有前、后两个，后方的一般较大，病羊粪便越稀，滋养体数目越多，运动越活泼，后伸缩泡也越大，甚至可达滋养体的二分之一[8]。

图1 羊结肠小袋纤毛虫滋养体，粪便直接压片 (400×)

2.3 粪便水洗沉淀物染色结果粪便沉淀物水洗后，可见为数众多的结肠小袋纤毛虫包囊。包囊为休眠期虫体，呈球形或卵圆形，灰黄或淡绿色，无纤毛，不运动，有2层囊膜，外膜较内膜稍厚，有时还可见到处于脱水浓缩期的包囊，其染色结果见中插彩版图2～5。羊结肠小袋纤毛虫包囊美蓝染色30 min，囊膜不着色，呈红色，在囊膜外残留的滋养体期的外膜呈淡蓝色，外质淡蓝色，内质深蓝色，食物泡和伸缩泡呈淡蓝色，胞核呈深蓝色(中插彩版图2)。羊结肠小袋纤毛虫包囊2%碘液染色30 min，胞膜不着色，呈红色，内质深黄色，外质、伸缩泡和胞核呈土黄色(中插彩版图3)。羊结肠小袋纤毛虫包囊瑞氏染色24 h，囊膜外层淡蓝色，内层为淡红色，外质淡红色，内质、食物泡和胞核呈紫红色(中插彩版图4)。羊结肠小袋纤毛虫包囊苏木素染色12 h，胞浆呈黄色，胞核淡红色；染色24 h，胞浆粉红色，食物泡和胞核呈深紫红色(中插彩版图5)。包囊的染色时间远远多于滋养体，说明包囊膜结构致密，通透性差，不易着染，而滋养体由于有胞口和胞肛的存在，通透性强，易于染色。

2.4 药物敏感性试验结果羊结肠小袋纤毛虫滋养体对药物的敏感性试验结果见表1。

表1 羊结肠小袋纤毛虫滋养体对药物的敏感性试验结果

判定标准：无羊结肠小袋纤毛虫滋养体存活的孔标记为(-)，有羊结肠小袋纤毛虫滋养体存活的孔标记为(+)

本药敏试验中，血虫净、土霉素片、盐酸左旋咪唑、复方新诺明、痢特灵和氨苄青霉素钠对羊结肠小袋纤毛虫滋养体的绝对致死浓度LC100分别为：0.195 mg/mL、0.391 mg/mL、3.125 mg/mL、12.5 mg/mL、50 mg/mL和50 mg/mL，丙硫苯咪唑和乳酶生在浓度小于50 mg/mL时对羊结肠小袋纤毛虫滋养体无效，甲硝唑和中药驱虫净散在浓度低至0.025 mg/mL时，仍然杀灭了全部的结肠小袋纤毛虫。本试验显示，药物治疗结肠小袋纤毛虫病时，甲硝唑治疗效果优于血虫净，这与刘翠等人的研究结果一致[9]。

2.5 药物防治试验结果甲组病羊治疗后第7天，除1只母羊仍有轻微腹泻症状，1只4月龄羔羊死亡外，其余均无明显症状，粪便饱和硫酸锌漂浮法发现还有3只羊呈现阳性，粪便转阴率为73.33%(11/15)，继续治疗6 d后，全部康复，治愈率为93.33%(14/15)。乙组病羊治疗后第10天，有2只母羊仍有轻微腹泻症状，其余均痊愈，且末出现死亡病例，粪便饱和硫酸锌漂浮法发现还有3只羊呈现阳性，粪便转阴率为80%(12/15)，继续治疗6 d后，全部康复，治愈率为100%(15/15)。结果可以看出，用甲硝唑和中药驱虫净散治疗羊结肠小袋纤毛虫病，均取得显著疗效，但治疗时一定要保证药物的剂量和疗程，确保粪便中羊结肠小袋纤毛虫全部被杀死，防止疾病反复。

3 讨论

3.1 粪便中羊结肠小袋纤毛虫的分离、固定与染色粪便中含有纤维素、细菌、蛋白质、沙粒等异物，会影响羊结肠小袋纤毛虫的制片和观察的效果。新鲜粪便经直接涂片发现羊结肠小袋纤毛虫后，可采用生理盐水1 500 r/min离心水洗3～5次，再用2.5%戊二醛固定，可以洗掉虫体表面和纤毛上吸附的蛋白质等异物。离心管中进行染色、脱水后制片观察，可以避免染色和脱水时，虫体(特别是包囊)易脱落的现象。如染色过深，常规的做法是用1%盐酸乙醇脱色，其脱色的时间很短，很难操作和控制，特别是在离心管中染色时更难，另外，脱色后虫体颜色发灰发暗，很难染出色泽艳丽、层次分明的标本，如采用反复水洗脱色，可达到理想的染色效果。

3.2 药物对结肠小袋纤毛虫滋养体的杀灭试验本试验建立了羊结肠小袋纤毛虫滋养体的药物敏感性试验方法，该方法将药液在平底96孔细胞培养板上进行倍比稀释，与等量的结肠小袋纤毛虫滋养体培养悬液混合，28 ℃作用12 h，在倒置显微镜下观察结果，测定药物的致死浓度(LC100)，该方法简便、快捷、直观和实用。临床上也可以直接将新鲜粪便加液体培养基搅匀，粪网筛过滤，必要时进行离心浓集，制成滋养体悬液进行试验，以选出兽医临床防治的有效药物。

试验结果显示, 甲硝唑具有较好的抗羊结肠小袋纤毛虫滋养体活性效果，可用作临床的首选治疗药物，其次是血虫净和土霉素，这与抗猪结肠小袋纤毛虫滋养体的试验结果一致[9-10]。中药驱虫净散对结肠小袋纤毛虫滋养体的LC100浓度低至0.025 mg/mL，优于其他常山、青蒿等中草药制剂[11]，同时中药驱虫净散具有抗线虫、绦虫和球虫等活性，有广阔的应用前景。

3.3 羊结肠小袋纤毛虫的药物治疗目前，以甲硝唑为代表的硝基咪唑类药物是抗滴虫、阿米巴原虫和结肠小袋纤毛虫的首要选择，但其具有潜在的致癌和致突变作用[12]，而且容易产生耐药性，因此开发安全、有效、绿色的甲硝唑类药物的替代品已成为必然。本文治疗羊结肠小袋纤毛虫的中药驱虫净散以其广谱、高效、安全的特点，有较高的推广价值。本病治愈后，依然存在摄入结肠小袋纤毛虫包囊的可能性，所以羊场一旦发生该病，就很难清除，要加强饲养管理，定期检查和驱虫，做到早诊断，早治疗。