枸杞花药培养研究

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(1.湖北工程学院生命科学技术学院， 湖北 孝感 432000； 2.宁夏枸杞工程技术研究中心， 银川 750004)

枸杞(LyciumLinn.)是名贵的药食同源型植物。花药培养在品种选育及遗传分析中非常重要，顾淑荣等[1]以宁夏枸杞为试材，对取材时期、培养基、蔗糖浓度、激素浓度等作了探讨，并获得了单倍体植株。樊映汉等[2]以宁夏枸杞为试材，采取含单核晚期花粉的花药培养，由胚状体发育形成小植株。顾淑荣等[3]对枸杞未成熟的胚乳进行培养获得完整植株；曹有龙等[4]采用枸杞花药进行离体培养，建立细胞系，诱导植株再生。罗青等[5]对枸杞花药胚状体诱导的影响进行了研究。本试验通过对枸杞愈伤组织诱导率、绿苗分化率及根诱导率进行研究，为今后的枸杞遗传图谱构建、QTL标记等遗传学研究提供一个有价值的基础材料群体。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

试验材料枸杞花蕾于2008年5—6月采自宁夏农林科学院枸杞研究中心枸杞种质资源圃。

1.2 试验方法

采集枸杞花萼绿色、花药淡黄绿色的花蕾。剥去花萼，在无菌条件下用1 mol/L HCl消毒1 min，用无菌水冲洗3次，在70%乙醇中消毒30 s，用无菌水冲洗3～4次，在0.1%HgCl2溶液中消毒8 min，再用无菌水冲洗3次，将花蕾置于已灭菌的滤纸上。用镊子剥出花药，去净花丝，接种到诱导培养基中，放在26 ℃条件下进行暗培养，30 d后统计各处理愈伤组织数。出愈率(%)=愈伤组织块数/接种花药数×100%；采用DPS统计分析软件对试验数据进行方差分析、多重比较。

1.2.1 激素配比浓度对枸杞花药愈伤组织诱导的影响

诱导培养基采用MS培养基，生长素2,4-D和细胞分裂素6-BA组合，每种激素各5个水平：0，0.2，0.5，1.0，2.0 mg/L。培养基中添加0.8%琼脂、5%蔗糖。研究激素配比浓度对枸杞花药愈伤组织诱导率的影响。共25个处理，每个处理接种20瓶。

1.2.2 接种密度对枸杞花药愈伤组织诱导的影响

以100 mL三角瓶为培养容器，花药接种在MS+KT 0.2 mg/L+IAA 2.0 mg/L+5%蔗糖+0.8%琼脂培养基上； 1) 2蕾/瓶(10枚花药)； 2) 4蕾/瓶(20枚花药)； 3) 6蕾/瓶(30枚花药)； 4) 8蕾/瓶(40枚花药)； 5) 10蕾/瓶(50枚花药)； 6) 12蕾/瓶(60枚花药)； 7) 14蕾/瓶(70枚花药)； 8) 16蕾/瓶(80枚花药)； 9) 18蕾/瓶(90枚花药)。共9个处理，每个处理接种20瓶。

1.2.3 不同培养方式对枸杞花药愈伤组织诱导的影响

以宁杞1号为试材，采用固体、液体、固液2层等3种培养方式，固体培养基采用MS+KT 0.2 mg/L+IAA 2.0 mg/L+5%蔗糖+0.8%琼脂；液体培养基采用MS+KT 0.2 mg/L+IAA 2.0 mg/L+5%蔗糖；固液2层培养，采用下层是固体培养基30 mL，上层是液体培养基10 mL，共3个处理，每个处理接种20瓶。

1.2.4 愈伤组织芽的分化

为进一步诱导器官分化，将愈伤组织切成0.5 cm见方小块，转入含不同激素组合的MS分化培养基上，研究不同激素组合对枸杞花药芽分化的影响。每瓶2～3块愈伤组织，每处理接种50瓶。

1.2.5 生根培养

从芽基部切开，去除基部愈伤组织，转入MS+6-BA 0.2 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂培养基中使其增殖，当得到大量健壮无根苗后，从基部切下，再转入含不同浓度的激素MS培养基中诱导生根。

2 结果与分析

2.1 花药中产生愈伤组织和胚状体的过程及特性

枸杞花粉发育成单倍体植株有2种途径：一种是花药中的花粉形成愈伤组织后分化出不定芽，再发育成植株；另一种是花药中的花粉通过胚状体阶段发育为小植株。花药在诱导培养基上培养1周后，大部分花药开始膨胀， 花药由淡绿色慢慢的变为浅黄色，局部发生褐变。2周后，花药由浅黄色变为棕褐色，3周后陆续在花药壁上、花丝端部或花药裂缝处长出愈伤组织(图版Ⅰ，1)，有的在花药开裂处长出绿色伸长的结构即胚状体，胚状体进一步发育，下胚轴伸长，长出叶片，发育长胚芽(图版Ⅱ，12～15)，之后发育成具有根茎叶的再生植株(图版Ⅱ，16～18)，有的显现2片子叶(图版Ⅱ，10～11)，子叶“带帽”(实为花药)(图版Ⅱ，23)。

枸杞花药诱导的愈伤组织主要有5种类型： 1) 灰白色或灰褐色、松软湿润、呈泥状(图版Ⅰ，4)，经过30 d的培养，分化出苗的频率很低，大部分逐渐褐化死亡； 2) 淡黄色松散型(图版Ⅰ，5)，这种类型的愈伤组织质地松散、颗粒小、分散性能好，胚性细胞多、分化频率高； 3) 黄白色质地坚硬紧密型(图版Ⅰ，6)，质地坚硬，不易分散，经过40 d的分化培养，只是体积增大，仍然保持黄白色不易分散，不易分化出苗； 4) 嫩绿色松散型(图版Ⅰ，3)，一般都是从花药开裂处长出，分化频率较高； 5) 黄绿色、质地较硬、生长缓慢及表面有颗粒突起的愈伤组织。在诱导培养基中超过50 d之后颗粒状突起形成绿色的芽点直接分化出许多绿色的小苗(图版Ⅰ，7)，无需转入分化培养基。除以上5种类型外，也有的愈伤组织是介于它们之间的过渡类型。实验中观察到愈伤组织主要以第2种为主。有时在同一培养基中出现2种或2种以上类型的愈伤组织。

2.2 激素配比浓度对枸杞花药愈伤组织诱导率的方差分析

对2，4-D和6-BA组合所获得的愈伤组织诱导率进行极差分析，结果(表1)表明，2，4-D、6-BA和它们之间的交互作用均呈极显著差异。根据F值的大小可知：一定浓度的2，4-D与6-BA配合使用对愈伤组织的诱导率比单独使用影响更大。由于两因素对愈伤组织的诱导能力呈显著差异，故用LSD法对2，4-D 和6-BA激素配比浓度五水平进行多重比较。

多重比较分析结果(表2，表3)表明，同一因素五水平之间的花药愈伤组织诱导率均有较大的差异，激素6-BA对枸杞花药愈伤组织诱导率的影响，是随着6-BA浓度的递增而递增。而激素2，4-D是随浓度的递增，其愈伤组织诱导率先增后降。6-BA五水平之间，浓度2.0 mg/L与其它4个浓度间呈极显著差异，浓度1.0 mg/L和浓度0.5 mg/L间差异不显著；2，4-D五水平之间，浓度1.0 mg/L与其它4个浓度间呈极显著差异，浓度2.0 mg/L和浓度0.5 mg/L间差异不显著。2，4-D 1.0 mg/L与6-BA 2.0 mg/L均获得较高的愈伤组织诱导率，因而MS+1.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA为较优组合，这与试验中处理的结果相吻合[6]。

表1 激素配比浓度对枸杞花药愈伤组织形成的影响试验结果方差分析

变异来源平方和自由度均方F值p值6-BA274.5040468.62608.0350**0.00092,4-D224.2080456.05206.5630**0.00256-BA×2,4-D136.6480168.540526.6890**0.0001误差8.0000250.3200总变异643.360049

注：“**”表示0.01水平上显著。

表2 激素配比浓度对枸杞花药愈伤组织形成的影响中6-BA五水平多重比较

水平(mg/L)平均愈伤组织诱导率(%)5%显著水平1%极显著水平2.07.1600aA1.03.8400bB0.53.4600bB0.22.1400cC00.0000dD

表3 激素配比浓度对枸杞花药愈伤组织形成的影响中2，4-D五水平多重比较

水平(mg/L)平均愈伤组织诱导率(%)5%显著水平1%极显著水平3.9800bB1.06.5000aA0.53.9800bB0.21.8800cC00.2600dD

2.3 接种密度对枸杞花药愈伤组织诱导的影响

统计结果如图1所示，在不同的接种密度条件下愈伤组织诱导率有所不同，接种密度由10枚/瓶增加到50枚/瓶时，诱导率从0.6%猛增至4.5%，接种密度以50枚/瓶为佳。但当超过50枚/瓶后，每瓶愈伤组织块数在增加，但愈伤组织诱导率在下降。

注：1为花药诱导出的愈伤组织；2为淡绿色愈伤组织；3为嫩绿色松散型的愈伤组织；4为灰白色或灰褐色、松软湿润、呈泥状的愈伤组织；5为淡黄色松散型的愈伤组织；6为黄白色质地坚硬紧密型的愈伤组织；7为黄绿色或黄色、块状、质地较硬、表面有颗粒状突起的愈伤组织；8为分化前的愈伤组织；9为增殖的疏松愈伤组织；10为愈伤组织分化出绿点；11为分化出芽；12为生根培养；13为健壮的再生植株；14为白化苗；15为叶片发紫的再生植株。图版Ⅰ 花药愈伤组织形成和植株再生

注：1～3为胚状体；4为分生出一片子叶胚状体； 5为筒状叶；6为棒状； 7～9为扇形叶； 10-11为分生出2片子叶胚状体；12～15为胚状体形成的再生芽；16～18为分化出叶片和根的小植株；19为具有叶片和根的小植株，显现2片子叶，子叶“带帽”(实为花药)；20为具有双子叶特征的小植株。图版Ⅱ 花药胚状体形成和植株再生

2.4 不同培养方式对枸杞花药愈伤组织诱导的影响

统计结果如图2所示，在不同培养方式下花药诱导率均不同，固体培养诱导率较高，为3.1%，固液2层培养花药诱导出少量的愈伤组织和胚状体，在液体培养条件下，花药培养1周后没有明显膨胀，颜色由黄绿色渐渐转为浅褐色，只诱导出极少量的愈伤。

表4 不同植物激素对枸杞愈伤组织分化频率的影响

激素种类和浓度 (mg/L) 愈伤组织数(块)再生植株的愈伤组织数(块)分化频率(%)特征6-BA2.01201411.7绿色,玻璃化芽多,生长差6-BA1.0120108.3绿色,玻璃化芽多,生长一般6-BA0.512086.7淡绿,芽正常,生长一般6-BA1.0+NAA0.51201310.8黄绿,芽正常,有愈伤组织产生6-BA0.5+NAA0.0112097.5黄绿,芽正常,生长旺盛6-BA0.5+NAA0.512054.2黄绿,芽正常,生长较差KT112000褐化KT1+NAA0.112000褐化死亡KT1+NAA0.512000白色紧密型愈伤组织

表5 不同植物激素对枸杞根形成的影响

激素种类和浓度(mg/L) 接种苗数根发生数根诱导率(%)不定根生长状况6-BA1.0 1000NAA0.2 10880根多,粗壮IAA0.5 10330根少,纤细6-BA0.01+NAA0.210990根多,粗壮

图1 不同接种密度对枸杞花药愈伤组织诱导的影响

图2 不同培养方式对枸杞花药愈伤组织诱导的影响

2.5 愈伤组织芽的分化

选取直径为1～3 mm的愈伤组织块(图版Ⅰ，8)接种在MS分化培养基中，分化培养1周后愈伤组织局部转绿，2周后愈伤组织体积增殖3～5倍(图版Ⅰ，9)，分化出绿色的芽点(图版Ⅰ，10)，绿色的芽点2周左右分化成幼芽(图版Ⅰ，11)，有的愈伤组织分化出玻璃化的叶片，有的愈伤组织不分化直接褐化死亡。从表4可以看出，6-BA浓度在1.0～2.0 mg/L时，每块愈伤组织得苗数多，但玻璃化苗也多，浓度降至0.5 mg/L时，愈伤组织分化频率略有下降，但分化出的苗正常。6-BA和NAA配合使用，能显著提高愈伤组织的分化频率，愈伤组织也得到了增殖。单独添加KT或KT和NAA配合使用，未分化出芽。比较几种培养基分化结果，以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L为最好。

2.6 根的形成

诱导培养基和分化培养基上再生的芽要及时转移到生根培养基中，否则苗的基部又会转化为愈伤组织。为了诱导根的发生，将芽转入附加3%蔗糖和0.8%琼脂、pH=6.0、含不同激素的MS生根培养基中，在含IAA和NAA的MS培养基上得到了具有根系的完整植株，从表5可以看出，其中以MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.01 mg/L的培养基效果最好。在试验中通过愈伤组织获得部分无根苗转入生根培养基中发紫，最后木质化死亡。通过胚状途径获得1株白化苗(图版Ⅰ，14)；在后面的扩繁过程中转化成正常苗，虽然没通过倍性鉴定，据有关资料显示，这是典型单倍体特征。有的再生植株部分叶片发紫(图版Ⅰ，15)，通过多次的扩繁转化为正常苗。通过多次的继代和生根培养形成大量健壮的再生植株(图版Ⅰ，13)。

3 讨 论

激素在花药培养中非常重要，在愈伤组织诱导过程中，虽然有仅用简单的无机盐和蔗糖培养基就可以诱导小孢子分裂的报道[7]，但对大多数植物来说，若不在基本培养基中添加激素，其小孢子将无任何反应。根据前人研究，2，4-D作用强，可使小孢子的第1次均等分裂和具有均等核的花粉增多； 6-BA可以提高花粉胚状体的产生和增强形成根的趋势[8]。本次实验以宁杞1号为试材，进行不同梯度2，4-D和6-BA组合实验，二者不同浓度配比对愈伤组织诱导率不同。其中2，4-D 1.0 mg/L和6-BA 2.0 mg/L为最佳的激素组合，在实验中获得胚状体较少，顾淑荣研究表明，在诱导培养基中加入1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，胚状体的诱导率高达16.9%[1]。与本次实验结果差异，其原因还有待进一步研究。

接种密度也影响花药愈伤组织的诱导率， Fouletier和Michelloh最早在水稻的花药培养中观察到密度效应，此后花药培养的密度效应在烟草、水稻和大麦中也有一些研究[9-11]。花药密度提高，花药本身释放到培养基中的花药因子也增加，只有当花药因子的浓度达到一定阈值时，花药愈伤组织才能形成[9]。本次实验中，接种密度50枚/瓶时花药诱导率最高，接种密度在0～20枚/瓶或90枚/瓶时花药诱导率非常低，可见接种密度过高或过低都会抑制花药的愈伤组织。

通过合适的培养方式获得最佳的通气与营养吸收环境是花药培养获得成功的重要方面[12]。本次实验结果表明，枸杞花药固体培养基培养优于其他培养方法。在固体培养中，花药能较长时间的保持淡黄绿色，花药膨胀形成愈伤组织，液体培养中花药容易发生褐化，固液2层培养中花药只诱导出少数的愈伤组织，可能是液体培养通气不良造成的。

高浓度6-BA使枸杞花药愈伤组织分化出的芽玻璃化，只有0.5 mg/L的6-BA和0.01 mg/L NAA配合使用，可以使枸杞花药愈伤组织得到较好的分化。在少数愈伤组织上生成不定根，可能是培养基中添加NAA的缘故，NAA有促进花药愈伤组织生根的作用。0.2 mg/L NAA与0.01 mg/L 6-BA配合使用，枸杞生根效果比较理想。将无根苗转入生根培养基中诱导其生根，待根须形成后，将茎切段转入快繁培养基中，能有效控制玻璃化苗的出现。对于枸杞花药培养所需的植物生长调节剂条件仍有待进一步的研究。