分子标记辅助选择在甜瓜抗病育种研究中的应用

张爽爽 王利波 陈 莹 张金鹏 耿 伟 惠长敏*

（吉林省蔬菜花卉科学研究院 长春 130033）

甜瓜是重要的园艺作物，也是深受人们喜爱的十大水果之一，但是甜瓜在整个栽培过程中受到多种病害的威胁，其中白粉病、枯萎病、蔓枯病最为严重，已严重影响甜瓜的产量和品质。目前，解决甜瓜生产过程中病害问题最有效的途径就是培育具有综合抗病性的甜瓜新品种。分子标记辅助选择可以大大缩短育种周期、显著提高育种效率，已成为甜瓜抗病育种研究中主要的技术手段[1]。以DNA序列为基础的分子标记因重现性好、准确性高、操作简单等优点已成为分子标记辅助选择的理想标记类型[2]。随着高通量测序技术的发展，以DNA序列为基础的分子标记已广泛的应用在甜瓜抗病育种研究中。本文就分子标记辅助选择在甜瓜抗病育种研究中的应用进行了综述，旨在为培育具有综合抗性的甜瓜新品种提供参考。

1 分子标记辅助选择概述

分子标记辅助选择（markerassistantselection，MAS）是指在基因克隆或定位的基础上，通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记，在群体中对含有目标性状的个体进行选择[1、3]。MAS可以在植株早期对含有目标性状的个体进行快速、准确的选择，而且不受外界环境的影响，在一定程度上解决育种过程中存在盲目性、效率低的问题，大大加快了育种进程。

选择合适的分子标记是MAS在实际应用中的首要工作。分子标记的发展经历了三个阶段：第一代是以传统的分子杂交为基础的分子标记，如RFLP、VNTR；第二代以PCR技术为基础的分子标记，如RAPD、SSR、AFLP；第三代是以基因组序列为基础的分子标记，如SNP、InDel[2、4]。近年来，随着分子生物学的快速发展以及高通量测序成本的降低，以基因组序列为基础的分子标记应用的越来越多。应用于MAS的分子标记需要与目标性状位点紧密连锁或者存在共分离现象，才能准确地对个体进行选择。简而言之，选择有效的分子标记才能快速、精确地在基因组水平对个体进行选择，达到辅助传统育种方法的目的，高效地进行育种工作。

2 分子标记辅助选择在甜瓜抗病育种中的应用

2.1 分子标记辅助选择在甜瓜抗白粉病育种中的应用

白粉病是危害甜瓜生产的一种世界性病害，在甜瓜整个生育期内均可发生。白粉病主要危害甜瓜叶片，导致植株光合能力下降，引起植株早衰甚至死亡，已成为影响甜瓜生产中的主要障碍[5]。引起甜瓜白粉病的主要病原菌是单囊壳白粉菌（Podosphaeraxanthii）和二孢白粉菌（Golovinomycescichoracearum），其中单囊壳白粉菌（P.xanthii）起主导作用，甜瓜白粉病菌生理小种多、分化快，给白粉病的防治工作带来一定的困难[6]。因此开展白粉病抗性基因的研究及培育抗白粉病品种是解决甜瓜白粉病的重要突破口。

张海英等研究发现甜瓜材料K7-1对P.xanthii2F的抗性是由显性单基因Pm-2F控制，并筛选到与Pm-2F紧密连锁的两个SSR标记，但是这两个标记在辅助甜瓜抗白粉病育种的应用中还有局限性[7]。许勇团队在之前的科研基础上开发出与Pm-2F更紧密的CAPS/InDel分子标记[8、9]。研究结果表明，CAPS-HphⅠ、CAPS-DdeⅠ、InDel02与抗白粉病基因Pm-2F呈紧密连锁，连锁距离分别为0.26cM、0.35cM、0.12cM；InDel01与抗白粉病基因Pm-2F呈现共分离。在120份甜瓜种植资源中验证这四个标记的准确性，CAPS-HphⅠ、CAPS-DdeⅠ、InDel02标记鉴定结果与田间符合率分别为93.3%、91.6%、97.5%，InDel01标记鉴定结果与田间符合率为100%。验证结果表明上述分子标记可有效地运用在筛选抗白粉病种质资源研究中。

李冰等以抗病甜瓜自交系MR-1为母本，感病自交系Top Mark为父本，构建了含有346份材料的F2代群体。利用BSA法（BulkedSegregationAnalysis） 及 NGS技术（Next-Generation Sequencing）对MR-1中白粉病基因进行研究[10]。结果在甜瓜12号染色体上获得了与抗白粉病基因紧密连锁的分子标记BSA12-LI3ECORI和BSA12-LI4HINFI，连锁距离分别为0.02cM和0.28cM。赵玉龙利用BSA12-LI4HINFI标记对355株自然群体及76株双亲群体进行抗白粉病的筛选，结果BSA12-LI4HINFI标记在验证自然群体材料的田间符合率为96.3%，验证双亲群体材料的田间符合率为100%；研究结果表明BSA12-LI4HINFI标记能够准确地判断植株是否抗病，可以应用于生产实践。

Fernando J等以含有TGR-1551基因型的抗病材料和西班牙地方品种感病的“BoladeOro”为研究对象，构建了含有159份材料的F2代群体。利用BSA法识别到8个与抗病相关的AFLP标记，通过对AFLP片段的克隆及序列分析，得到了6个以PCR为基础的共显性标记[11]。其中PM4-dCAPS标记可以扩增出一段109bp的序列，在这段序列上存在三个SNP位点，用限制性内切酶NcoⅠ进行酶切，可将感病植株的序列切成86bp和23bp两段，而抗病植株的序列则不被切断。林琳利用PM4-dCAPS标记对17个材料的白粉病抗性进行鉴定，得到了13份对白粉病有抗性的材料[12]。

2.2 分子标记在甜瓜抗枯萎病育种中的应用

甜瓜枯萎病是由甜瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.melonis）引起的一种土传性病害[13]。枯萎病典型症状是萎蔫；发病初期，植株叶片从基部向顶部逐渐发生缺水状萎蔫，中午明显，早晚可恢复；发病严重后植株叶片全部萎蔫，不再恢复直至枯死[14]。甜瓜专化型尖孢镰刀菌有四个生理小种，分别为race0，race1，race2，race1、2。已报道的甜瓜抗尖孢镰刀菌的基因有3 个，分别为 Fom-1（抗 race0 和 2，但感 race1，race1、2）、Fom-2（抗 race0 和 1，但感 race2，race1、2）、Fom-3（抗 race0，1 和 2，但感race1、2），目前唯一克隆出来的是 Fom-2[15、16]。

王士伟以高抗枯萎病的美国甜瓜和高感枯萎病的仙果027-5厚皮甜瓜为试验材料，克隆了Fom-2基因的LRR区核苷酸序列，通过软件分析在抗病植株和感病植株的序列之间存在3个SNP位点，将SNP位点进一步转化成功能性分子标记。利用限制性内切酶酶切和等位基因特异性PCR两种方法，在高抗和高感枯萎病材料的F1和F2代群体中验证SNP位点的有效性和可靠性，结果表明Fom-2 LRR区SNP位点2和3处可以转化为枯萎病抗性相关的功能性分子标记[17]。林琳用Fom-2LRR区标记鉴定17份材料对枯萎病生理小种0和1的抗性，结果筛选到1份纯合抗性材料，1份没有抗性材料，15份杂合抗性材料[12]。

赵玉龙以MR-1和WI998为试验材料，根据对两亲本的重测序结果，针对Fom-2蛋白的SCOP结构功能域（富含LRR的结构功能域）的核苷酸序列进行扩增，设计CAPS引物，开发与Fom-2紧密连锁的CAPS分子标记[15]。在开发出的7对引物中有1对可以准确鉴定植株对枯萎病的抗性。利用355个自然群体及76个F2代群体对该引物的准确性进行验证，结果在自然群体中分子标记鉴定结果与田间符合率为94.8%，在亲本群体中分子鉴定结果的田间符合率为100%。说明该引物能够精确地判断植株是否感病，可以应用于生产实践。

AIL等以对Fom-1有抗性的“Charentais-Fom1”和无抗性的“TGR-1551”为试验材料，构建F2代群体，在400对RAPD引物中筛选到3对在抗病、感病植株间存在差异的引物，通过PCR对片段进行克隆并分析差异序列的碱基，开发出与Fom-1基因连锁的SCAR标记[18]。通过在群体材料中验证，得到了能鉴定感或抗生理小种0和2的分子标记SV01574。林琳用SV01574标记鉴定17份材料对枯萎病生理小种0和2的抗性，结果筛选到14份对生理小种0和2有抗性材料[12]。

2.3 分子标记在甜瓜抗蔓枯病育种中的应用

甜瓜蔓枯病是一种世界性土传病害，也是危害我国甜瓜生产的主要病害。在甜瓜伸蔓到坐果期间易发病，田间发病率可达30%以上。蔓枯病主要危害植株茎蔓和叶片；茎部多在茎基部和节部发病，破坏植株茎部皮层组织使整个植株逐渐干枯收缩、表皮龟裂和剥落，最终导致植株死亡[19]。对甜瓜蔓枯病抗性资源研究最早是PI140471材料，其抗性由单个显性基因Gsb-1提供，之后的一些抗病品种的抗性大多来源于此材料。2004年美国康奈尔大学筛选到五种抗性资源，分别为PI482398（单个显性基因Gsb-4控制其抗性）、PI482398（由单个显性基因 Gsb-4控制其抗性）、PI157082（由单个显性基因Gsb-2控制其抗性）、PI511890（由单个显性基因Gsb-3控制其抗性）和PI140471（由单个显性基因Gsb-1控制其抗性）[20]。目前已开发出多个与上述资源抗性基因连锁的分子标记并已应用在抗蔓枯病的育种研究中。

张永兵（2007）以抗蔓枯病的材料PI1482398及感病的甜瓜自交系白皮脆为亲本，建立了抗、感F2代群体，利用BSA法筛选64对AFLP引物，其中一对引物在抗、感基因池中扩增出一条分子量为285bp的特异条带，经双亲、F1及F2代抗、感单株验证，该特异条带在抗性单株中出现[21]。张永兵（2011）以抗蔓枯病种质资源PI157082与感病的甜瓜自交系白皮脆为亲本，建立了含有134份材料的抗、感F2代群体，利用BSA法筛选72条ISSR引物。其中共有3条引物在F2代抗、感基因池中扩增出多态性片段，用双亲、F1和F2代抗、感单株对这3条引物进一步验证，其中引物ISSR-57扩增出的多态性条带与抗性基因Gsb-2表现连锁关系，遗传距离为11.3cM，定名为ISSR-57560。ISSR-PCR扩增体系稳定、重复性好，ISSR-57560可以作为甜瓜抗蔓枯病辅助选择的备选分子标记[22]。

王红英等以抗蔓枯病自交系PI482398（含抗蔓枯病基因Gsb-4）和感病自交系白皮脆为试验材料，构建F2代群体，利用BSA法对89对SSR引物进行筛选，其中引物CMTA170a在抗性材料中可扩增出约为120bp的条带。利用软件对该标记与抗性基因Gsb-4之间的遗传关系进行连锁分析，结果表明：该标记与抗性基因Gsb-4存在连锁关系，遗传距离为5.14cM[23]。

姜陆以抗蔓枯病甜瓜品种IranH和以感蔓枯病甜瓜品种Hami413为试验材料，构建128株F2代分离群体，利用法BSA法筛选出甜瓜抗病池与感病池中扩增出差异条带的10对SSR分子标记引物[24]。通过对分离群体中的单株进行检测，根据分离群体中蔓枯病抗、感的情况，筛选与分离后代中抗、感情况较为吻合的候选分子标记2个为后续抗性甜瓜材料中抗性基因的定位奠定基础。

3 总结

目前对甜瓜生产过程中发生的白粉病、枯萎病及蔓枯病并没有完全有效的防治措施，甜瓜一旦被白粉病、枯萎病及蔓枯病病菌侵染，被治愈的可能性很小。解决甜瓜生产过程中病害问题最经济、有效的途径就是培育具有综合抗性的甜瓜品种，减少病菌对甜瓜的侵染。前文综述了近年来报道的与甜瓜白粉病、枯萎病及蔓枯病相关的分子标记，为利用分子标记辅助选择技术培育具有综合抗性的甜瓜新品种提供参考。随着测序技术的迅速发展及测序成本进一步降低，国际公共数据库序列信息将越来越丰富，分子标记开发的可利用资源逐步增加，为开展甜瓜基因组水平上的研究提供了前所未有的机遇。今后在甜瓜的抗病育种研究中，分子标记辅助选择技术将具有及其广阔的应用前景和利用价值。