拟南芥丝氨酸羧肽酶KL58分析

李翠 郝福顺 王晓阳 孙立荣

摘 要：植物丝氨酸羧肽酶（SCP）以及丝氨酸羧肽酶类蛋白（SCPL），具有参与催化蛋白水解反应、伤应答反应，合成芥子酰基苹果酸和油菜素内酯的作用。然而，这类蛋白是否调节植物应答其它逆境胁迫反应还不清楚。我们课题组以拟南芥T-DNA插入突变体库筛选获得一株对低钾反应敏感的突变体，命名为kl58（K+ lower mutant 58）。KL58属于SCP类蛋白家族，我们采用一些生物学基本技术，对该突变体进行了一些基本分析，以期为该方向的研究奠定基础。

关键词：丝氨酸羧肽酶；KL58；Tail-PCR

丝氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidases， SCP）是一类主要大量而广泛地存在于高等植物或真菌和动物组织中的真核生物细胞蛋白水解酶类。它参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个关键环节，主要涉及如种子萌发过程中贮藏蛋白的水解、细胞程序性死亡中胞内组分自溶、创伤反应、抗逆等多个生理过程。目前，通过Northern杂交技术，RT-PCR技术分析和原位杂交技术等方法，从大麦、小麦、拟南芥等植物中分离到了SCP及SCP类蛋白（SCPL）的基因及它们编码的蛋白质。研究人员发现水稻的SCPL家族中的OsBISCPL1基因，它主要在根部、叶片和叶鞘等部位中表达量比较高，在茎部表达量相对较低。另外还发现，OsBISCPL1过表达植株表现出对氧化胁迫的耐受性增加和相关的氧化胁迫基因表达上调。同时，还发现OsBISCPL1基因可能参与植物体对防御病原体感染的反应和抵抗氧化胁迫的调节。从烟草中分离得到的胞外型丝氨酸羧肽酶Ⅲ型基因NtSCP1和NtSCP2，在各个组织中都均有不同程度的表达，体外纯化的His 标签NtSCP1蛋白具有羧肽酶活性。

先前已经对SCP和SCPL编码基因的部分进行了研究，但针对某一类基因或某些基因的功能还鲜有人报道。

一、主要实验方法

1.β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色：将GUS染液加入离心管中，放入材料，避光，37℃染色2-4 h，依次用50%、75%、100%的乙醇脱色10 min。

2.拟南芥根细胞的质壁分离：将生长7 d的转基因植株幼苗根浸泡在0.8 M甘露醇溶液中10-15 min，结束后用显微镜观察。

3.DAPI染色：将生长7-8 d的转基因幼苗浸泡到DAPI染液中，染色15-20 min后，用蒸馏水清洗3-4次，显微镜下观察。

二、结果与分析

1.拟南芥KL58基因的获得：在MS培养基上，该突变体与WT长势和株型上没有明显差异，然而在含400M K+的培养基上，WT和kl58的生长都受到了不同程度的抑制，突变体植株矮小，侧根减少，叶片萎蔫。与WT相比，kl58对低钾胁迫更敏感（如图2-1 A-2）。通过Tail-PCR技术确定导致kl58缺失的基因，如图2-1 B 所示，从左向右的电泳泳道分别是第四轮、第三轮、第二輪、第一轮。把第四轮的目的条带切胶回收，测序结果显示，T-DNA反向插入在AT2G22920终止密码子最后一个碱基前第四个碱基处，AT2G22920为丝氨酸羧肽酶基因SCP12。RT-PCR分析发现kl58中KL58没有表达，而WT中能够正常扩增出KL58的转录产物（图2-1 C），说明kl58为基因完全缺失突变体。

2.KL58基因主要在幼苗根部表达：为了确定KL58的组织化学定位，构建了KL58pro：：GUS转基因材料（图2-2 A、B）。利用GUS染液染色，图2-2 C显示出了KL58在转基因植株种子、幼苗、成苗、花、果荚中的组织表达情况，从图中看出，KL58在种子中没有表达；在3天幼苗的根部表达量最高，并且除去根尖外，其余根部都有大量表达，包括根的中柱和根毛；在3天的幼苗下胚轴和叶子中都没有表达。在生长5天的KL58pr：：GUS植株中，同样是根部表达量也非常高，几乎整个根部都有表达，少量根尖除外；与生长3天不同的是5天幼苗下胚轴的基部有大量表达，在叶子中没有表达。生长7天的幼苗根部表达量也非常高，下胚轴的基部有少量表达，叶子中没有表达。而在第7天以后，根部的表达量较弱，11天个别叶子中有少量表达，下胚轴基部和根部衔接的部位表达量很高，在根部的其它部位，没有观察到有KL58的表达。在生长14天的幼苗中，植株的整个根部只能看到个别主根部位和侧根部位有表达，下胚轴基部有少量表达，叶子中有少量表达。而在生长了21天的成苗中，只有个别根和叶子有少量表达。在花序结构中，花萼部分看到有少量表达，在花的其它结构如花药、花丝、柱头、花柱、子房等中都没有观察到表达，并且在花托部位也没有观察到表达。在果荚中也没有观察到KL58的表达。综上所得，KL58在生长3-7天的幼苗根部表达量最高。

3.KL58亚细胞定位分析：为了观察KL58基因亚细胞定位情况，构建了永久表达35S：：pEGAD：：KL58-GFP材料（图2-3 A）。

将35S：：pEGAD：：KL58-GFP稳定表达的转基因拟南芥种子点在MS培养基上培养，将生长7 d左右的幼苗在激光共聚焦显微镜下进行GFP荧光扫描观察。结果在幼苗根部检测到了GFP绿色荧光（图2-3 A）。从图中我们可以看到，绿色荧光主要分布在细胞的周围，也就是在细胞壁或者是细胞膜的部位，另外，还可以看到在个别细胞的内部也有颜色很亮的荧光，这个部位可能是细胞核。那么为了确定KL58是定位在细胞壁还是细胞膜，于是设计的质壁分离实验，发现GFP荧光出现在根细胞质膜部位（图2-3 B），而在细胞壁处没有发现荧光。为了确定KL58是否在细胞核中存在，设计了DAPI染色实验。细胞中的细胞核能够被DAPI染成蓝色。图2-3 C所示，染DAPI的视野，颜色比较深的即为细胞核，绿色荧光视野中颜色深的部分与DAPI染色深的部分不重叠，说明KL58没有定位在细胞核中。

4.KL58在细菌中诱导表达及Western-Blot检测：为了测定KL58是否具有丝氨酸羧肽酶活性，我们构建原核表达载体，在体外表达出蛋白。图2-4A是载体构建后的验证电泳图。

为了在体外诱导表达出KL58蛋白，将上述所得到的重组KL58-pET-28a质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，即将重组质粒转入蛋白表达菌株。摇菌，用IPTG诱导融合蛋白表达，然后进行SDS-PAGE分析，结果显示（图2-4B 左），经0.3 mM IPTG诱导后，未诱导的菌液中没有表达蛋白，诱导后全细菌裂解液含较多分子量大小与目的蛋白一致的条带，即很可能为目的蛋白，而细菌裂解液經离心后的上清液中目的条带的量较少，收集大量菌后才能为后续酶活性测定纯化到到大量蛋白。为了验证诱导出来的蛋白确实为带His标签的目的蛋白，于是做了Western-Blot检测，结果显示诱导大量表达出来的目的条带确实为His标签融合蛋白（图2-4B）。

三、结语

RT-PCR分析证明，KL58在kl58中没有表达。然而后期多次重复实验发现，kl58在低钾胁迫下的表型不稳定。为揭示KL58的功能，研究了kl58在高铁、高锌、低锌等胁迫下的表型，结果显示，在这些胁迫下突变体与WT在生长和发育方面没有显著差别。构建了KL58pro：：GUS 载体，同时获得了阳性GUS转基因植株，对植株生长时期的各个部位进行组织化学染色，观察到KL58在幼苗的根部表达较高，在幼苗期的叶子中表达较低，在种子、果荚及花序结构中没有表达。构建了KL58基因融合绿色荧光蛋白（GFP）基因载体，研究KL58的亚细胞定位情况，证明KL58定位在细胞膜上。为确定 KL58是否具有丝氨酸羧肽酶活性，构建了KL58-pET-28a原核表达载体，并且成功在细菌中诱导表达出了该蛋白，为测定其丝氨酸羧肽酶活性奠定了基础。

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作者简介： 李翠（1987-），女，汉族，河南中牟人，现供职单位：郑州电子信息职业技术学院 ，学位：理学硕士，研究方向：植物分子生物学。

通讯作者简介：孙立荣（1968-），女，汉族，籍贯：山东省烟台市莱山区高新区，供职单位：河南大学，职称：副教授，学位：理学博士，研究方向：植物逆境生物学。

基金项目：河南省教育厅科学技术研究重点项目（15A210018）和国家自然科学基金项目（31070239）。