响应面法优化离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶

曾颖，朱新儒，余垒，李雄，张海德

（海南大学食品学院，海南海口570228）

番木瓜（Carica papaya L.）原产于墨西哥南部以及邻近的美洲中部地区。在我国主要分布在广东、海南、广西、云南、福建、台湾等省（区）。木瓜蛋白酶（papain）是存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内的一种低特异性蛋白水解酶，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于含巯基（-SH）肽链内切酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品[1]、医药[2]、饲料[3]、日化[4]、皮革[5]及纺织[6]等行业得到广泛应用。木瓜蛋白酶是100%的天然物质，因此在食品及饮料工业上有独特的广阔发展前途[7]。

离子液体，又称低温熔融盐，是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成的盐。由于离子液体具有非常独特的理化性能，非常适合于用作分离提纯的溶剂。2003年，Gutowski等采用亲水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑盐酸盐（[Bmim]Cl）和磷酸钾（K3PO4）首次提出了离子液体双水相体系这一概念。离子液体双水相相较于传统双水相既为蛋白质的萃取营造了温和的环境，又避免了萃取过程中有机溶剂的使用，具备萃取率高、两相界面清晰、黏度低、绿色环保、操作简便等优点。因此近年来在分离生物活性物质方面迅速发展并在分离生物活性物质[8-9]方面被广泛研究。

本试验利用离子液体双水相对木瓜中的木瓜蛋白酶进行分离纯化，旨在从方法上寻求新的突破，为木瓜蛋白酶的纯化提供更多的理论依据和技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木瓜蛋白酶（BR，>2 000 U/mg）：生工生物（上海）股份有限公司；[C2mim]Ac、[C4mim]Ac、[C6mim]Ac、[C8mim]Ac：兰州雨陆精细化工有限公司；K2HPO4（分析纯）：广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

TU1901紫外可见分光光度计：北京普析通用有限责任公司；DK-98-1型恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司；HJ-5型多功能恒温搅拌器：常州华奥仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质测定方法

用Bradford法[10]来测定蛋白质的含量。以牛血清白蛋白为标准品配制系列浓度的标准溶液，1.0 mL样液加入5 mL考马斯亮蓝G-250染色液5.0 mL，反应5 min左右在595 nm波长下测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线的回归方程为：A595=0.007x+0.000 5，R2=0.999 2。

1.3.2 双节线的测定

在295.15 K的条件下采用浊点法制作双节线[11]。分别配制一定浓度（质量分数为60%左右）的离子液体溶液于大试管中，逐滴加入一定浓度的盐溶液，直到溶液刚好变浑浊，记下消耗的盐溶液体积。再加入重蒸水使溶液澄清，重复上述操作。计算出在溶液浑浊时离子液体和盐的质量分数，以盐的质量分数为横坐标，离子液体质量分数为纵坐标绘制相图。

1.3.3 分配系数测定

配制一定量的的离子液体、无机盐和木瓜蛋白酶溶液，震荡混匀后以5 000 r/min离心10 min，读取上下

式中：cT和cB分别为双水相体系中上下相的蛋白酶的浓度，mg/mL。

1.3.4 单因素试验

离子液体侧链烷基对分配系数的影响：以相图为指导，用不同的离子液体配制相同质量组成的双水相，固定离子液体和K2HPO4的质量分数分别为25%、18%，加入等量适量的酶液，测定木瓜蛋白酶的分配系数。

离子液体浓度对分配系数的影响：配制离子液体浓度为20%、24%、28%、32%、36%，K2HPO4浓度固定为18%的双水相，加入等量适量的酶液，测定木瓜蛋白酶的分配系数。

K2HPO4浓度对分配系数的影响：保持[C8mim]Ac浓度为24%不变，根据相图，选取K2HPO4浓度为16%、18%、20%、22%、24%的双水相体系。加入等量适量的酶液，测定木瓜蛋白酶的分配系数。

pH值对分配系数的影响：双水相pH值分别调节为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，K2HPO4浓度为 18%，[C8mim]Ac浓度为24%，加入等量适量的酶液，测定木瓜蛋白酶的分配系数。

1.3.5 响应面试验

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，根据单因素试验结果，对离子液体浓度（A）、盐浓度（B）、pH值（C）这3个因素进行优化，采用三因素三水平的响应面分析方法进行试验设计，以分配系数（K）作为考察指标，获得木瓜蛋白酶的最佳条件萃取条件。试验因素水平见表1。相的体积，测定上下相的蛋白浓度，分配系数（K）的计算公式如下：

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM（response surface methodology）

2 结果与分析

2.1 双节线的测定及关联

本试验研究了[Cnmim]Ac（n=2，4，6，8）和 K2HPO4的相形成能力，[Cnmim]Ac（n=4，6，8）与 K2HPO4的相图见图1。

图1 [Cnmim]Ac（n=4，6，8）与 K2HPO4的相图Fig.1 Phase diagram of the[Cnmim]Ac（n=4，6，8）with K2HPO4

双节线越靠近原点，则成相能力越好，从图1可以看出咪唑类醋酸盐的成相能力为：[C8mim]Ac>[C4mim]Ac>[C6mim]Ac。一般情况下离子液体阳离子侧链烷基越长，则离子液体疏水性越强，更容易形成双水相。而[C2mim]Ac难以与K2HPO4形成双水相。

用Merchuk[12]方程对双节线数据进行关联。

式中：WIL、WS分别表示离子液体和盐的质量分数，%；a、b、c为方程参数。双节线数据关联结果见表2。

表2 双节线数据关联结果Table 2 Binodal correlation results

由表2，可以看出对双节线数据的关联效果非常好。

2.2 单因素试验

2.2.1 离子液体侧链烷基对分配系数的影响

以相图为指导，用3种离子液体配制相同质量组成的双水相，固定离子液体和K2HPO4的质量分数分别为25%、18%，加入等量适量的酶液，结果如图2所示。

木瓜蛋白酶的分配系数随着离子液体阳离子侧链烷基的增加而增大。咪唑类醋酸盐离子液体的疏水性随侧烷基链增长缓慢加强，因此长链烷基可能更有利于木瓜蛋白酶被萃取到上相中。因此，选取萃取效果最好的[C8mim]Ac来进行下一步试验。

2.2.2 离子液体浓度对分配系数的影响

离子液体质量分数变化对木瓜蛋白酶分配行为的影响见图3。

图2 离子液体烷基侧链变化对木瓜蛋白酶分配行为的影响Fig.2 Effects of the alkyl chain length of ionic liquids on the partition behavior

图3 离子液体质量分数变化对木瓜蛋白酶分配行为的影响Fig.3 Effects of the mass of ionic liquids on the partition behavior

固定K2HPO4浓度为18%，配制[C8mim]Ac浓度为20%、24%、28%、32%、36%的双水相，由图3可知K值先上升后下降，在[C8mim]Ac浓度为28%时取得最大值11.44。随着[C8mim]Ac浓度增加（>28%），富含离子液体的上相体积也会增加，虽然可能对酶的萃取量变大了，但是上相酶浓度也会随上相体积的变大而降低，所以总体的K值开始下降。

2.2.3 K2HPO4浓度对分配系数的影响

K2HPO4浓度变化对木瓜蛋白酶分配行为的影响见图4。

图4 K2HPO4浓度变化对木瓜蛋白酶分配行为的影响Fig.4 Effects of the mass of K2HPO4on the partition behavior

于是保持[C8mim]Ac浓度为28%不变，选取K2HPO4浓度为16%、18%、20%、22%、24%。图4得出，K值先增大后减小，这可能是因为K2HPO4质量分数的增加导致了盐析作用增强，木瓜蛋白酶转移到上相。但是同时上相的水分子慢慢减少，与蛋白质表面的氨基酸残基形成氢键能力减弱，当[C8mim]Ac浓度过大时上相的黏度增加，也会阻碍木瓜蛋白酶的转移能力。

2.2.4 pH值对分配系数的影响

pH值变化对木瓜蛋白酶分配行为的影响见图5。

图5 pH值变化对木瓜蛋白酶分配行为的影响Fig.5 Effects of pH on the partition behavior

根据图5得知：随pH值的增大，K呈现先增大后下降的趋势，并在pH=9时取得最大值。pH值对离子液体双水相中酶分配系数的影响是通过酶与成相物质之间的氢键效应和电荷效应来实现的。蛋白质作为两性分子，其带电性质受介质值的影响[13]。当pH值大于等电点，蛋白质带负电荷，与的离子液体的咪唑阳离子之间发生静电作用。咪唑类离子液双水相体系中，蛋白质表面的氨基酸残基与离子液体阳离子之间的疏水相互作用是萃取分离蛋白质的主要动力[14]。

2.3 响应面试验设计及方差分析

2.3.1 响应面试验结果

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，根据单因素试验结果，对离子液体浓度（A）、盐浓度（B）、pH 值（C）这 3个因素进行优化，以分配系数（K）作为考察指标。根据响应而分析试验设计原理进行响应面试验，响应面设计及结果如表3所示。

表3 响应面试验设计方案及结果Table 3 Experimental design and results of RSM

续表3 响应面试验设计方案及结果Continue table 3 Experimental design and results of RSM

2.3.2 回归模型建立及显著性分析

利用软件进行多元回归拟合，得到分配系数K的二次多项式回归模型如下：

对回归模型进行方差分析和回归系数的显著性检验，结果如表4和表5所示。

表4 回归模型的方差分析Table 4 Variance analysis for the regression model

表5 回归模型的显著性检验Table 5 Significance test for the regression model

模型的失拟项均不显著（P=0.479 9>0.05），说明方程对试验拟合度很好。回归方程与实测值之间的拟合度可以通过相关系数（R2）和校正决定系数（Adj.R2）来解释。方程3的相关系数为99.7%，说明模型实测值和预测值之的拟合度都非常好。校正决定系数为99.31%，说明该回归模型可以解释99.31%的数据的变异性，因此可利用该模型对分配系数进行分析和预测。

从回归方程一次项系数的绝对值大小可评价该因素对试验指标影响程度[15]。方程2显示，各因素对分配系数K的影响顺序为pH值>[C8mim]Ac的质量分数>K2HPO4的质量分数在该水平范围内，AB、BC、AC、A2、B2、C2对K的影响极显著，A、B对K的影响显著。

2.3.3 响应曲面分析

在回归分析的基础上，根据回归方程拟合绘制响应面图，如图6所示。

图6 分配系数K的响应面和等高线图Fig.6 Responsive surface and contour plot of partition coefficient K

两因素间交互作用的强弱可以通过等高线图来判断，若等高线为圆形，则表示两者交互作用不显著，等高线图呈椭圆形，说明交互作用显著[16-17]。AC的交互作用较AB、BC而言对K的影响最为显著。

2.3.4 最优萃取条件的确定及模型验证

通过Design-Expert 8.0.5软件进行系统分析，得出 [C8mim]Ac-K2HPO4系统萃取木瓜蛋白酶的最佳萃取条件为：离子液体[C8mim]Ac浓度为28.03%，K2HPO4浓度为20.08%，pH值为8.55，此时分配系数K的预测值为11.65。按照优化条件进行3次平行验证试验以考察模型的可靠性，得分配系数的平均值为11.85，与预测值11.65非常接近，相差仅为1.69%。

3 结论

在同样的条件下，分别测定 [Cnmim]Ac（n=2、4、6、8）离子液体和K2HPO4的成相能力，[C8mim]Ac的成相效果比[C4mim]Ac、[C6mim]Ac都要好。利用Merchuk方程对双节线数据进行关联，相关系数都大于0.99，说明关联效果非常好，这为进一步试验奠定了基础。通过对各单因素的考察可知，[C8mim]Ac的萃取效果优于[C6mim]Ac和[C4mim]Ac，然后釆用响应面法优化离子液体浓度、盐浓度、pH值这3个因素，最佳条件下分配系数可以达到11.65。与预测值11.85非常接近，说明采用响应面法优化的提取条件可靠。