野葛花黄酮和花青素的提取及抗氧化性研究

（延安大学生命科学学院，陕西延安716000）

野葛花是豆科葛属植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）的花，呈蓝紫色，具有解酒醒脾保肝的功效[1-3]。研究表明，野葛花主要成分为黄酮类、皂苷类、挥发油类、甾醇类、生物碱和氨基酸等，其中以黄酮类成分含量最高[4-5]。黄酮类化合物主要分布在植物的花、叶、果部位，具有抗氧化、抑菌消炎、抗肿瘤、抗衰老等多种功能[6]。花青素属于黄酮类化合物，是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一，常见于花、果实的组织中及茎叶的表皮细胞与下表皮层[7]，具有较强的抗氧化、抗突变、保护肝脏、降血糖和抗发炎等功效[8-10]。野葛花长期作为我国的传统药物使用，其他方面的应用较少，尤其是野葛花中花青素类黄酮化合物的研究报道还不多见，对花青素提取的已有研究也是采用酶法[11]或传统浸提法[12]，这两种方法提取率较低。超声波作为一种辅助提取方法，通过增大溶剂分子的运动速度和穿透力，加快细胞破碎的速度，使溶剂快速的渗透到细胞中，提高有效成分的提取率和纯度[13]。基于此，本试验选用超声辅助乙醇提取野葛花黄酮和花青素，优化其最佳提取工艺条件，并初步研究了黄酮和花青素提取物的抗氧化性，以期为其综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

野葛花：江西上饶深山。

乙醇、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、抗坏血酸、水杨酸（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。

1.1.2 仪器与设备

WG-71型电热鼓风干燥箱、FW177型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；JA3003型电子分析天平：上海舜宇恒平科技仪器有限公司；721型可见分光光度计：浙江赛德仪器设备有限公司；DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅：上海百典仪器设备有限公司；YRE-2010-Ⅱ型旋转蒸发仪：郑州长城科工贸有限公司；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵：上海皖宁精密科学仪器有限公司；BL3-120型超声波清洗仪：上海比朗仪器制造有限公司。

1.2 黄酮提取试验方法

1.2.1 标准曲线制作

参照郭京波[14]的方法制作和绘制芦丁标准曲线。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到的标准曲线为y=0.010x+0.005，回归方差为R2=0.999。

1.2.2 野葛花黄酮提取和测定

准确称取1.00 g葛花粉末多份，置于250 mL锥形瓶中，按一定的液料比加入60%乙醇溶液，将锥形瓶放入恒温水浴锅内超声（300 W）辅助浸提，提取，然后用真空泵抽滤，将滤液倒入100 mL容量瓶，暂时保存。再将滤渣按相同条件进行二次提取，抽滤后用乙醇定容至100 mL容量瓶中，得黄酮提取液。采用Na（NO2）-Al（NO3）3-NaOH法测定黄酮[15]。根据回归方程计算出提取液中黄酮的质量浓度，然后计算野葛花中黄酮得率（%），公式为：

式中：C为提取液中总黄酮浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；N为稀释倍数；W为称量的野葛花质量，g。

1.2.3 单因素试验和正交优化

分别考察了料液比、提取时间和温度3个因素对野葛花黄酮得率的影响。首先，在料液比分别为1∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），提取时间 90 min，提取温度50℃的条件下，考察料液比对黄酮得率的影响；其次，在提取时间分别为 90、100、110、120、130 min，料液比1∶30（g/mL），提取温度50℃的情况下，考察提取时间对花青素得率的影响；最后，在提取温度分别为 30、40、50、60、70 ℃，料液比 1 ∶30（g/mL），提取时间90 min条件下，考察提取温度对黄酮得率的影响。在单因素试验的基础上，选择料液比、提取时间和提取温度3个因素的各3个较优水平进行L9（34）正交试验，对野葛根黄酮的提取工艺进行正交试验优化。

1.3 花青素提取试验方法

1.3.1 野葛花花青素提取和测定

称取1.00 g野葛花粉末，加乙醇溶液（pH=3.0）超声（300 W）辅助浸提、抽滤后，50℃减压浓缩，之后用蒸馏水定容至100 mL得花青素提取液。采用pH值示差法测定花青素含量[16]。花青素溶液在525 nm处有最大吸收，选择1.0和4.5两个pH值对花青素溶液进行定量分析，计算溶液中花青素得率，公式为：

式中：M=449.2，是矢车菊-3-葡萄糖苷的相对分子质量；ε=29 600，为矢车菊-3-葡萄糖苷的消光系数；DF为取样测定时的稀释倍数；V为总的提取溶液体积，L；W为称量的野葛花质量，g。

1.3.2 单因素试验和正交优化

分别考察提取温度、乙醇浓度、提取时间和料液比4个因素对野葛花花青素提取得率的影响。首先，在提取温度分别为 30、40、50、60、70 ℃，乙醇浓度60%，料液比为1∶30（g/mL），提取时间 60 min的情况下，考察提取温度对花青素得率的影响；其次，在乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%，料液比为1∶30（g/mL），提取时间 60 min，提取温度 60℃条件下，考察乙醇浓度对花青素得率的影响；再次，在提取时间分别为 60、80、100、120、140 min，乙醇浓度 60%，料液比为1∶30（g/mL），提取温度60℃的情况下，考察提取时间对花青素得率的影响；最后，在料液比分别为 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL），乙醇浓度60%，提取时间60 min，提取温度60℃的情况下，考察了料液比对花青素得率的影响。在单因素试验的基础上，选择提取温度、乙醇浓度、提取时间及料液比4个因素的各3个较优水平进行L9（34）正交试验，确定野葛根花青素的最佳提取工艺参数。

1.4 羟基自由基清除试验

野葛花黄酮、花青素及VC对羟基自由基的清除率，采用水杨酸法[17]进行测定。对羟基自由基的清除率按下式计算：

式中：A0为空白对照液的吸光值；Am为分别加入黄酮、花青素及VC后的吸光值；An为不加H2O2时的吸光值。

1.5 数据处理

数据经Excel2003、SPSS19.0等软件进行整理、分析与作图。

2 结果与分析

2.1 野葛花黄酮的提取工艺

料液比、提取时间和温度对野葛花黄酮得率的影响见图1。

图1 料液比、提取时间和温度对野葛花黄酮得率的影响Fig.1 Effect of solid/liquid ratio，extraction time and extraction temperature on the flavonoids yield of Flos Puerariae

由图1的单因素试验结果可知，料液比、提取时间、提取温度对野葛花黄酮得率均有明显影响作用。黄酮得率随料液比增加逐渐增加，在1∶30（g/mL）时达到最大值，之后略有下降；随着提取时间的延长和提取温度的升高，黄酮得率分别在100 min和40℃时达到最大值，之后明显下降。由此确定，提取野葛花黄酮的单因素水平应分别控制在料液比1∶30（g/mL），提取时间100 min，提取温度40℃为宜。

根据单因素试验结果，确定料液比、提取时间和提取温度的 3 个水平 [1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40（g/mL）；100、110、120 min；30、40、50 ℃]进行正交试验（表1）。

表1 野葛花黄酮提取正交优化结果Table 1 Results of orthogonal experiment of flavonoids of Flos Puerariae

结果发现，各因素对野葛花黄酮得率的影响效果依次为料液比（A）＞提取时间（B）＞提取时间（C），最佳提取工艺为 A2B2C2，即料液比 1 ∶30（g/mL），提取时间110 min，提取温度40℃。验证试验表明，在此条件下黄酮得率为2.84%。

2.2 野葛花花青素提取工艺

野葛花花青素提取的单因素试验结果见图2。

图2 提取温度、乙醇浓度、提取时间和料液比对野葛花花青素得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature，ethanol concentration，extraction time and solid/liquid ratio on the anthocyanins yield of Flos Puerariae

随着乙醇浓度的升高，花青素得率逐渐上升，在70%时达到最大值，之后明显下降；料液比、提取温度和提取时间的变化规律相似，随着3个因素水平的增加，花青素得率均先上升之后略有下降，分别在1∶30（g/mL）、60℃和120 min时达到最大值。由此确定，提取野葛花花青素的单因素水平应分别控制在乙醇浓度70%，料液比1∶30（g/mL），提取温度60℃，提取时间120 min为宜。

根据单因素试验结果，确定提取温度（50、60、70℃）、乙醇浓度（50%、60%、70%）、提取时间（100、120、140 min）和料液比[1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）]的 3个水平进行正交试验。野葛花花青素提取正交优化结果见表2。

表2 野葛花花青素提取正交优化结果Table 2 Results of orthogonal experiment of anthocyanins of Flos Puerariae

续表2 野葛花花青素提取正交优化结果Continue table 2 Results of orthogonal experiment of anthocyanins of Flos Puerariae

结果发现，各因素对野葛花花青素得率的影响效果依次为提取温度（A）＞乙醇浓度（B）＞料液比（D）>提取时间（C），最佳提取工艺为A2B2C2D2，即提取温度60℃，乙醇浓度60%，提取时间120min，料液比1∶30（g/mL）。验证试验表明，在此条件下花青素得率为2.17%。

2.3 对羟基自由基的清除作用

野葛花黄酮和花青素对羟基自由基的清除率见图3。

图3 野葛花黄酮和花青素对羟基自由基的清除率Fig.3 The hydroxy radical scavenging rate of the flavonoids and anthocyanins from Flos Puerariae

由图3可知，在一定范围内，随着浓度增加，野葛花黄酮、花青素和抗坏血酸对羟基自由基清除率均逐渐增强，说明三者对羟基自由基的清除能力均存在着一定的量效关系。在相同质量浓度下，野葛花黄酮对羟基自由基具有较好的清除作用，效果高于花青素；野葛花黄酮和花青素对羟基自由基的清除效果明显高于抗坏血酸。

3 讨论

黄酮类物质是野葛花的重要成分之一。本试验利用超声辅助乙醇提取法测定野葛花黄酮的含量，通过正交试验设计优化其工艺条件，在最佳提取条件下野葛花黄酮得率为2.84%，相比同类传统提取方法，超声辅助提取黄酮得率明显高于传统芦丁提取法（1.61%）[12]，但低于超声辅助萃取葛花总黄酮得率（5.19%）[18]。这可能与试验材料不同，采用的标准品以及提取方法不同有关。超声波会导致植物细胞破裂，加速细胞中有效成分溶出，缩短提取时间和降低溶剂使用量，提高经济效益。可见，超声辅助提取法有助于提高黄酮提取物得率，为后续野葛黄酮的工业化提取奠定了理论基础。

花青素属于黄酮类化合物，但是其立体结构和性质随pH值和温度的变化而变化，导致其呈现不同颜色[7，19]。因此，花青素和黄酮的测定方法虽有相似之处，但是提取工艺侧重点不同。本试验利用pH值示差法检测花青素，并采用超声辅助来提高花青素的浸提得率，通过正交试验优化得出花青素得率高达2.17%，略高于酶法浸提法得到的盛花期葛花花青素得率（2.12%）[12]。研究表明，超声辅助浸提花青素的效率比相同条件下热浸提（70℃）提高50%以上[20]。可见，超声辅助提取法有助于提高花青素得率。花青素活性较高，稳定性较差，作为一种天然食用色素，安全性高，资源丰富，但富含花青素的原材料价格较高[21-22]，而野葛在我国分布很广，繁殖能力很强且花期较长，野葛花中含有丰富的花青素，可以作为花青素的廉价原材料，用于开发天然食用色素。

黄酮和花青素的分子结构决定了其抗氧化性强弱。黄酮和花青素均含有酚羟基，酚羟基能够提供质子直接参与自由基的清除，清除自由基的能力与酚羟基的数目有关，酚羟基数目越多，供氢能力越强，去除自由基的能力就越强[23-25]。黄酮B环上的羟基提供质子的能力最强，是黄酮分子清除自由基，发挥抗氧化活性的主要部位[26-27]。花青素含有多个酚羟基，且含有多个酰化基团，酰基化花青素结构中的孤对电子可以作为氢供体，因而具有清除活性氧自由基的能力，表现出较强的抗氧化性[28]。本试验结果表明野葛花黄酮和花青素对羟基自由基的清除效果明显优于抗坏血酸，且清除作用与浓度呈剂量关系，野葛花黄酮和花青素具有较强的抗氧化性。这与紫色甘薯花色苷对羟自由基的抗氧化能力[29]以及葛花、秀丽槭叶等总黄酮的抗氧化能力[30-31]研究结果一致。可见，野葛花是具有开发应用潜力的野生植物源天然抗氧化剂，在食品保质保鲜等方面表现出极大的开发潜能。

4 结论

本研究通过超声辅助乙醇提取野葛花中黄酮，其最佳工艺条件为料液比为1∶30（g/mL）、提取温度为40℃、提取时间为110 min，野葛花黄酮最佳得率为2.84%。利用超声辅助pH示差法提取野葛花花青素，其最佳工艺条件为乙醇浓度60%，料液比1∶30（g/mL），时间120 min，温度60℃时，花青素含量高达2.17%。野葛花黄酮和花青素对羟自由基的清除效果明显优于抗坏血酸，且清除作用与浓度呈剂量关系。本研究结果可为开发应用野生植物源天然抗氧化剂提供理论支撑。