原花青素对糖尿病大鼠肾的保护作用

龚频，张梦璇，李晓凡，王兰，陈福欣

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021）（2.西安科技大学化学与化工学院，陕西西安 710054）

糖尿病是一种严重危害人类健康的内分泌代谢疾病，其并发症已成为继心脑血管疾病和肿瘤之后人类第三大致死原因。由于糖尿病患者代谢紊乱影响了清除自由基的各种抗氧化酶的活性和表达，引起自由基增多，进而损伤肾脏组织[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病引起的严重和危害性最大的一种慢性并发症，一旦进展到糖尿病肾病期，生化指标、肾脏病理情况常呈进行性恶化[2]，但在早期的临床表现不明显，其肾损伤尚轻微，这时若给予积极治疗，对控制糖尿病肾病的发生和发展有重要的意义。而肾对氧化损伤比较敏感，因此抗氧化治疗DN的方法越来越受到重视[3]。

原花青素(Proantho cyanidins，PC)属于多酚类化合物，其化学结构是基于黄烷-3-醇的C6-C3-C6的黄酮骨架，由儿茶素或者表儿茶素按照不同方式和数量聚合而成。其广泛存在于各种植物的核、皮或种籽中，如葡萄籽、蓝莓、肉桂、桑椹和野苹果等植物中均含有较为丰富的原花青素类成分[4]，由于原花青素的分子中具有多电子的羟基部分，使它拥有较强的抗氧化、清除自由基和抑制脂质过氧化的能力，是目前发现的最强效的氧自由基消除剂和脂质过氧化抑制剂之一[5]。有研究表明原花青素具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎、抗癌、治疗肠道感染、预防心血管疾病等药理活性[6～8]，近年来，越来越多的科研工作者开始关注原花青素在辅助治疗糖尿病方面的作用，但PC对DN是否具有保护作用目前国内外尚未见报道。为此，本研究通过建立糖尿病大鼠模型，探讨PC对糖尿病大鼠肾的保护作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

24只SD雄性大鼠，SPF级，体重160～200 g，购自西安交大医学院实验动物中心。动物生产许可证号：SCXK(陕)2012-003。

1.1.2 药品与试剂

PC，规格：每瓶25 g，购于上海源叶生物科技有限公司（批号：S30598）；链脲佐菌素(STZ)，规格：每瓶1 g，美国Sigma公司（批号：SB0130）；血清三酰甘油(TC)、总胆固醇(TG)试剂盒，购于南京建成生物技术公司；硫代巴比妥酸(TBA)、5,5-二硫代-2-硝基苯甲酸，2,4-二硝基苯肼(DNPH)，均购自上海品纯生化科技股份有限公司；考马斯亮蓝 G-250，瑞士阿达玛斯公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器

全波长扫描式多功能读数仪，芬兰赛默飞世尔科技有限公司产品；血糖仪，德国罗氏公司产品。

1.2 方法

1.2.1 模型的制备、分组

选取雄性SD大鼠24只，按照体重随机分为正常组，模型组，实验组，每组8只。正常组，给予普通饲料；模型组和实验组，给予高脂高糖饮食。饲养 6周后，禁食12 h，正常组，大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=4.4)；高脂高糖组，大鼠腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素。稳定1周后，对于空腹血糖＜7.8 mmol/L的大鼠，再次腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素。注射 1周后，尾静脉采血，测血糖≥13.8 mmol/L的大鼠为模型成功。模型组大鼠逐渐出现多饮、多食和多尿等典型的糖尿病症状；正常组饮水、摄食量、尿量基本正常，体重明显增加。造模成功的糖尿病大鼠随机分为模型组及实验组，每组8只。

1.2.2 给药剂量与方法

实验组，每日腹腔注射150 mg/kg原花青素，其余2组腹腔注射生理盐水，每天一次，连续注射4周。

1.2.3 生化指标检测

空腹12 h后，尾静脉采血测定。断颈处死，主动脉取血，离心分离血清，置-80 ℃保存，用于测定血清中 TC、TG、BG的含量；分离肾，取适量肾，于10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，供形态学观察；剩余肾组织，于-80 ℃保存，用于检测肾组织SOD、CAT活性和MDA、PCO的含量。

1.2.4 血清生化指标的测定

按照酶法试剂盒的要求，测定血清 TC、TG和BG含量。

1.2.5 肾脏组织生化指标的测定

取0.5 g肾脏，制成10%的生理盐水匀浆，离心分离上清液。肾皮质匀浆中MDA、PCO、SOD和CAT活性检测。

总蛋白质含量测定

本实验采用G-250考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。

大鼠肾脏中超氧化物歧化酶（SOD）活力测定：

SOD是一类含金属的氧化还原酶，几乎存在于所有生物细胞中，能够催化超氧化物通过歧化反应转化为O2和H2O2，与动物的寿命呈正相关，其活性大小可以反映机体清除自由基的能力，是生物体重要的细胞防御系统之一。在碱性条件下，邻苯三酚迅速氧化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系。SOD加入邻苯三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定 SOD活力的理论依据。与其他方法相比，邻苯三酚自氧化法具有操作简便，快速，试剂便宜且用量小，重复性好等优点。

大鼠肾脏中丙二醛（MDA）含量的测定：

丙二醛(MDA)是组织细胞膜脂质过氧化作用后的产物之一。细胞膜脂质过氧化的程度可以通过丙二醛浓度大小反映，也可间接通过其浓度大小反映组织的抗氧化能力强弱。酸性条件下，体内组织中的MDA在加热状态下与硫代巴比妥酸（TBA）生成粉红色结合产物，波长539 nm处结合产物有最大吸收。遂采用TBA比色法测定脏器组织中MDA的浓度，计算对比得到不同实验组别脂质过氧化的程度。

大鼠肾脏中过氧化氢酶（CAT）含量的测定：

测定组织中CAT含量本实验采用钼酸铵比色法。过氧化氢(Catalase，CAT)属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化体系中的过氧化氢，分解为H2O和O2，在此过程中起电子传递作用，同时残留的过氧化氢能够和钼酸铵反应生成黄色复合物，所以组织中CAT的含量和活性可以用可见分光光度计进行定量。

1.2.6 肾组织形态学检测

用10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚度5 μm。脱蜡后，用苏木精和曙红染色，制片，用光学显微镜进行观察。

1.2.7 统计学方法

2 结果与讨论

2.1 原花青素对糖尿病大鼠血糖和血脂影响

实验结果显示，与正常组比较，模型组血糖升高了4.17倍(p＜0.01)，TC、TG明显升高了4.02倍和6.88倍(p＜0.01)，大鼠出现明显的“三多一少”的症状；与模型组相比，PC能缓解大鼠糖尿病一般症状，且对STZ所致糖尿病小鼠有明显的降血糖作用，实验组的血糖、TC和TG水平明显降低了50.84%、55.70%和70.52%（p＜0.05），见表 1。

2.2 原花青素对糖尿病大鼠肾 MDA与 PCO含量的影响

MDA是典型的脂质过氧化产物[9]，PCO的含量可以反映蛋白质过氧化损伤的严重程度。图1结果表明，模型组糖尿病大鼠体内MDA、PCO含量明显高于正常组，分别升高了51.10%和81.36%(p＜0.01)，可以看出肾脏功能在一定程度上受到影响，可能是由于机体经STZ诱导的过程中，产生活性氧，这些含氧自由基具有未配对的价电子原子，会引起膜脂质过氧化的加剧，造成整个细胞膜系统损伤，肾脏损伤是大面积的肾间纤维化即与这一过程直接相关。在给予原花青素后，肾脏组织MDA、PCO含量显著降低到21.54%和11.86%（p＜0.01），表明PC可以缓解大鼠体内MDA、PCO含量升高，差异有统计学意义，表明PC可以减少糖尿病大鼠体内氧化应激。大量研究认为氧化应激在糖尿病肾病发病过程中起着至关重要的作用。当DNA发生后过度氧化应激对细胞膜表面进行过氧化，直接损害蛋白核酸[10]。目前，有关糖尿病肾病发病机制的研究认为，2型糖尿病患者体内胰岛素抵抗以及高糖环境所引起氧化应激反应、血管新生以及免疫功能紊乱被认为与糖尿病肾病产生密切的相关[11]。

图1 PC对糖尿病大鼠肾的影响Fig.1 The effect of PC on diabetic rats kidney

表1 原花青素(PC)对糖尿病大鼠血糖和血脂的影响Table 1 Effects of Proantho cyanidins (PC) on the level of blood glucose and blood fat of diabetic rats in different groups(±s)

表1 原花青素(PC)对糖尿病大鼠血糖和血脂的影响Table 1 Effects of Proantho cyanidins (PC) on the level of blood glucose and blood fat of diabetic rats in different groups(±s)

注：与正常组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p ＜0.001。

Group n Blood glucose/(mmol/L) Triglyceride/(mmol/L) Total cholesterol/(mmol/L)Control 8 4.6±0.5 0.56±0.05 2.36±0.21 Model 8 23.8±0.3 4.41±0.48*** 11.85±2.54**Test 8 11.7±0.3 1.30±0.37### 5.25±1.36##

2.3 原花青素对糖尿病大鼠肾CAT与SOD的影响

图2 PC对糖尿病大鼠肾的影响Fig.2 The effect of PC on diabetic rats kidney

过氧化氢是一种代谢废物，会损伤机体，CAT可以对这种损伤起到抑制作用。SOD可反映机体抗氧化能力，通过清除体内超氧阴离子自由基而保护细胞膜免受损伤[12]。图2结果显示，与正常组比较，糖尿病大鼠肾的CAT和SOD的活性均明显降低了17.61%和27.88%(p＜0.01)。给与原花青素后，肾脏组织中的SOD、CAT活性明显升高了26.05%和12.97%（p＜0.01）缓解了大鼠体内CAT含量的减少，同时抑制由于糖尿病而引起的SOD含量的降低。表明PC可通过改善机体抗氧化系统的功能，清除机体氧自由基，进而预防糖尿病肾病的发生。松树皮原花青素提取物对糖尿病小鼠有明显的降低血糖、改善血脂水平的作用，能够增加高脂联用STZ诱导的糖尿病小鼠血清中的SOD含量，降低MDA的含量，从而改善机体胰岛素抵抗，其与当前的研究结果相一致[15]。表明PC具有很强的抗氧化活性和清除自由基功能，是一种良好的脂质过氧化抑制剂和氧自由基清除剂[13,14]。

2.4 原花青素对糖尿病大鼠肾组织形态学的影响

图3 肾脏病理切片图Fig.3 Images of the kidney pathologic slice

从图3的肾组织形态学HE染色切片可见，空白组大鼠肾脏组织结构完整，有正常的肾小球结构，肾小球结构完整并无损害情况。而模型组大鼠则能观察到明显的细胞空泡，肾小球明显皱缩，肾小管结构模糊不清，也能观察到明显的细胞空泡，而肾小球系膜和外基质也出现了明显的增生现象。实验组上述病变有所减轻，肾小球结构基本正常，肾小管的损伤有了明显的改善。由此表明原青花素能够减轻糖尿病造成的肾小球和肾小管细胞压力，降低糖尿病患者体内肾脏的损害程度。

原花青素的结构含有多个酚羟基，能竞争性地与氧化物结合保护脂质化合物不被氧化，同时被氧化后释放出H+，可阻断自由基链式反应。韦金英等[16]研究表明葡萄籽原花青素能够明显减少db/db小鼠血糖，降低 Scr、BUN和高脂血症，降低 db/db小鼠的尿8-OHdG水平，抑制肾小管上皮细胞－间质转化生成，可能是通过抑制活性氧簇生成，抑制 p38MAPK和ERK 1/2信号通路激活而实现的。王卫娜[17]研究发现葡萄籽原花青素可以通过抑制GLUT2蛋白的表达，减轻DN大鼠的肾脏肥大指数，在一定程度上改善DN模型大鼠肾脏病理变化，缓解肾脏损伤。我们的研究同样表明了原花青素通过清除自由基，调节体内的氧化及抗氧化指标，平衡氧化压力，从而起到一定的抵抗糖尿病的保护作用。

3 结论

本实验通过高脂高糖联合小剂量 STZ诱导建立糖尿病大鼠模型，使糖尿病大鼠能量代谢产生紊乱，体内自由基增加，机体清除自由基的能力下降，胰岛素敏感性下降。结果显示，与模型组相比，PC可以显著降低大鼠血糖和血脂水平（p＜0.01），升高肾脏中的SOD、CAT活性，显著降低肾组织MDA、PCO含量（p＜0.01），表明PC可通过提高机体抗氧化能力，清除体内自由基来预防和治疗糖尿病及其并发症，但糖尿病的作用机制非常复杂，有待进一步研究。