健康人骨髓CD34+造血干/祖细胞衰老与年龄的相关性研究

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(1.重庆市第十三人民医院神内老年科，重庆 400053；2.重庆医科大学干细胞与组织工程实验室，重庆 400032)

老龄化问题日趋严重，成为社会科学与自然科学共同关注的热点问题之一。干细胞衰老学说是当今阐释衰老理论和老年性疾病发生与发展的最新学说，该学说认为人体衰老就是其干细胞衰老所致。我课题组既往实验证据证明[1-11]，小鼠造血干细胞随年龄增加或者周围环境变化及应激中出现衰老，且呈现出一定变化规律。与小鼠类似，人类的造血作用随年龄变化正常情况下可维持一种常态，但在周围环境变化及应激中可受到损伤，例如出血或癌症化疗的副作用导致造血干细胞被牵连,进而导致与骨髓发育不良和恶性肿瘤有关的血液疾病的风险增加，说明人类造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)也可能随老化而受损[12-13]。我们在此研究富含HSC和HPC的人CD34+细胞，希望通过观察不同年龄组人类造血干细胞与年龄相关的衰老变化特点，同小鼠数据进行对比，寻求干预人类HSC衰老的最佳干预时间，达到对一系列造血疾患的预防或治疗的目的。本课题组既往实验证据证明[1-11]，一些天然药物如人参皂苷Rg1及当归多糖可以通过双向调节，抑制正常造血干细胞衰老，而对肿瘤干细胞则促进其衰老及凋亡，起到预防肿瘤发生的作用。但何时为干预的最佳时机，希望通过本研究得到一点启示。

1 材料与方法

1.1 实验材料与分组

由重庆医科大学附属第一医院血液科骨穿室提供正常人骨髓9例，将其分为青年组3例(女性31岁、男性26岁、男28岁)、中年组3例(男性59岁、男性57岁、女性52岁)和老年组3例(男性70岁、男性70岁、女性62岁)。

1.2 主要药品与试剂

Human Anti-CD34 MicroBead Kit(FITC)(NO.130046703)，Mini MACS磁珠分选系统，MS磁珠分离柱，缓冲液(德国美天旎 Biotech公司)； 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(C0602，碧云天生物技术有限公司)，人干细胞集落形成实验专用混合培养基(Stem cell USA)，红细胞裂解液(碧云天生物技术有限公司)。Ficoll分离液(天津灏洋生物公司)。台盼蓝染液(C0011碧云天生物技术有限公司)。

1.3 免疫磁珠分离纯化人骨髓CD34+HSC/HPC及流式细胞术测定纯度腰椎穿刺获取各年龄组人骨髓，置于抗凝管中，上下反复颠倒混匀，置于冰盒里，将骨髓用生理盐水洗涤2次，移入离心管，离心后，加入5 mL红细胞裂解液置于4 ℃冰箱5 min，生理盐水洗涤，参照说明书，分离采集骨髓单个核细胞(BMNCs)，离心后用计数板计数细胞个数。取BMNCs 1×108个细胞加入100 μL Fcr blocking reagent、100 μL CD34 microbeads和300 μL Buffer，轻轻吹打混匀后4 ℃避光孵育30 min。将MS分选柱置于分离器磁场中，用干细胞专用buffer 冲洗MS柱2次。用一次性巴氏管将孵好抗体的细胞缓缓加到MS分选柱中，即将流尽后加1 mL buffer冲洗2次，向MS柱中加入1 mL buffer，用美天旎MS分选柱配套的活塞迅速推出柱子里的细胞，推出的细胞即为实验需要的人骨髓CD34+HSC/HPC。分别取MACS 分选前已标记MNCs和分选后阳性细胞1×106个，2 mL PBS 洗涤离心，使用流式细胞仪FACS Vantage SE ( 美国BD 公司) 检测。每个样品分析细胞数不少于2×104个细胞，用PC-LysysⅡ软件在VAX3300 微机上进行分析。计算磁珠分选前后CD34+细胞百分比[1]。

1.4 台盼蓝染色检测细胞的存活率

取CD34+HSC/HPC悬液每组各90 μL，加入台盼蓝染液(4 g/L)10 μL，染色后静置3 min计数，通过显微镜下细胞计数板进行观察及计数，透明不着色细胞为活细胞，着色胀大并染为淡蓝色的为死细胞，按下列公式计算活细胞率=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.5 各年龄组CD34+HSC/HPC衰老相关β-半乳糖

苷酶(SA-β-gal)染色取各组人骨髓CD34+HSC/HPC 1×105个， 参照细胞衰老β半乳糖苷酶染色试剂盒说明书方法对各组细胞进行染色。倒置相差显微镜下观察200个细胞，计数阳性细胞百分率。

1.6 各年龄组CD34+HSC/HPC形成造血干/祖细胞

混合集落(CFU-Mix)能力比较在离心管中收集各年龄组人CD34+造血干/祖细胞各4×104个，每组各加入1 mL干细胞混合集落专用培养基，用大号枪头轻轻混匀，不能有气泡，轻轻加到24 孔细胞培养板中，每孔0.5 mL，每天用显微镜观察细胞形态，培养到第7天时计数各组混合集落数并进行统计分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 免疫磁性分选前后CD34+HSC/HPC纯度比较

MACS分离纯化后较分选前CD34+HSC/HPC纯度明显增加(图1)，说明我们使用的分离纯化方法安全有效[1]。

2.2 台盼蓝染色检测细胞的存活率结果

各年龄组人骨髓CD34+造血干/祖细胞存活率均可达到99%以上，青年组(99.48±0.35)%，中年组(99.52±0.14)%，老年组(99.61±0.32)%。3组比较差异无统计学意义(P>0.05),说明我们分离的细胞存活率高，可用于后续的实验研究。

2.3 各年龄组人CD34+HSC/HPC衰老变化

取各组CD34+HSC/HPC，通过SA-β-半乳糖苷酶染色后阳性细胞为蓝色，细胞胞浆内可见蓝染颗粒；阴性细胞未着色青年组、中年组和老年组的阳性细胞数逐渐升高(图2)，分别为(7.67±2.7)%、(66.3±4.7)%和(82.0±6.0)%。说明人CD34+造血干/祖细胞的SA-β-gal染色阳性率出现明显的随增龄变化趋势。

a:磁珠分选前；b:磁珠分选后

*：与青年组比较，P<0.05

2.4 CD34+HSC/HPC混合集落形成能力比较

本实验结果显示，健康人类从青年到中年再到老年，CD34+HSC/HPC形成的CFU-Mix数量及其中细胞数逐渐减少，分别为(8.3±0.7)%、(6.3±0.7)%和(1.3±0.7)%，同年龄呈正相关(图3)。说明随年龄增加，人骨髓CD34+造血干/祖细胞增殖分化能力逐渐下降，与其衰老的结果呈正相关。

*：与青年组比较，P<0.05

3 讨论

有越来越多的证据表明，衰老会诱导分子途径的变化，从而加速干细胞和祖细胞突变的起始和/或克隆优势。老化相关的干细胞和祖细胞突变的积累与组织维持和癌症抑制失败之间的紧密联系表明这些因素之间的因果关系[13-14]。除了此处讨论的细胞内在机制之外，越来越多的证据表明，细胞外的影响因素影响干细胞的维持以及可能在衰老过程中选择突变干细胞和祖细胞。外部的影响因素包括老化相关的干细胞生态位缺陷，全身/血液循环环境改变[15-16]，干细胞与祖细胞增殖竞争变化[17]，炎症反应和受损细胞免疫监视缺陷等[18-19]。细胞和分子机制的相互作用的描述促成了老龄化背景下干细胞和祖细胞突变的启动和选择，这无疑将有助于改善老化相关的器官功能障碍和癌症早期发现、预防和风险评估。

随着年龄变化人类造血功能通常可以维持稳态，但环境因素及应激反应，如出血或癌症化疗副作用可能导致造血系统受损，并使造血干细胞被牵连[20-21]。因此普通肿瘤学通常建议减少老年人的化疗剂量，但这可能影响治疗效果。上述因素还会导致与骨髓发育不良和恶性肿瘤有关血液疾病的风险增加，说明实际人类造血干细胞(HSC)可能随老化而受损，类似于小鼠[22]。在小鼠中已经广泛研究了衰老HSC的影响，但是直到目前，针对人类的研究还是较少。在小鼠中，衰老的影响是变异依赖性的，并且增殖的HSC的数量与寿命相关[23-24]。在大多数小鼠品系中，HSC数量随年龄增长而下降，但在长寿命的C57B1小鼠中，HSC数量，特别是边群(SP)HSC数量增加，并且这些SP HSC在老年小鼠中具有增加的抗凋亡基因的表达。在小鼠和人类中，除了数量的变化，HSC的分化潜能朝向髓细胞(髓偏差)和远离B淋巴细胞。T细胞库的构成也在数量和产生胸腺细胞的功能上显著降低[10-11]。有研究显示HSC衰老后，由于受损的DNA修复及端粒缩短而出现衰老的损害，但是这对于人类的影响是不确定的。可能人类随年龄增长出现HSC衰老，进而影响人类身体机能和造血系统的衰竭[25-28]。Xiao等[28]研究证实，在各种病理条件下活性氧物质( ROS )的增加损害了HSC的自我更新，并主要通过诱导HSC衰老而导致HSC过早衰竭和BM抑制，癌基因诱导ROS和DNA损伤的积累以及随后的细胞衰老，这是阻止转化细胞生长形成肿瘤的重要障碍。

β-半乳糖苷酶染色结果显示，随年龄增加各组人CD34+HSC/HPC逐渐出现明显的衰老，老年组阳性率明显高于中年组及青年组。CD34+HSC/HPC混合集落形成能力研究还发现，健康人类从青年到中年再到老年，CD34+HSC/HPC形成的CFU-Mix数量及细胞数逐渐减少，同年龄呈正相关。这和SA-β-半乳糖苷酶染色结果一致，说明随着年龄增加，CD34+造血干/祖细胞出现衰老，这导致其增殖分化能力降低，进而可能导致人体出现造血功能的异常。本研究结果提示，人类造血干细胞在中年时期可能就开始出现衰老。人参皂苷Rg1(Rg1)是人参中最活跃的成分之一，已被证明具有抗氧化和抗衰老的特性。Rg1对小鼠暴露的慢性地塞米松(5 mg/kg，28 d)诱导的神经炎症损伤有保护作用。我课题组发现：Rg1通过增强BMSCs的抗氧化和抗炎能力，改善造血微环境的抗衰老能力。人参皂苷Rg1的通过抑制氧化应激抵抗HSC/HPC对电离辐射诱导的衰老[10]。另外，人参皂苷Rg1能够保护睾丸免受D-gal诱导的小鼠衰老，并且Rg1的保护作用可以通过抗氧化和p19/p53/p21等信号传导途径的下调来实现[29]。根据本实验结果，如果使用Rg1之类抗衰老药物进行干预，是否需要在中年时期之前或者中期时期更为合适？这也是以后我们感兴趣的研究方向。