加工番茄PVYN：O HC-Pro、STV RdRp酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活验证

路 遥， 周 东， 郑银英

(石河子大学生命科学学院/石河子大学农业生物技术重点实验室，新疆石河子 832003

新疆加工番茄病毒病日益严重，通过田间病毒检测发现马铃薯Y病毒(potato virus Y，简称PVY)和南方番茄病毒(southern tomato virus，简称STV)是造成新疆加工番茄病害的主要病毒，极大地减少了加工番茄的产量。马铃薯Y病毒是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的典型成员，根据寄主、生物学症状、基因组序列以及血清学特征可将PVY分为普通株系(common or ordinary strain)PVYO、烟草叶脉坏死株系(tobacco veinal necrosis strain)PVYN、马铃薯点刻条斑株系(potato stipple streak strain)PVYC、PVYZ以及PVYO和PVYN的重组株系PVYNTN、PVYN：O和PVYN-Wi[1]。梁学超等通过血清学检测发现，新疆加工番茄上PVYO、PVYO/N/C、PVYN检出率分别为20%、18.05%、0，且PVY不同株系总检出率达到24.9%，表明新疆加工番茄上PVY主要为PVYN：O株系和PVYO株系[2]。PVY为单链正义RNA病毒，只包含1个开放阅读框(ORF)，翻译成1个大的多聚蛋白，再利用蛋白酶将其加工成11个多功能蛋白(P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb、CP)[3-4]。HC-Pro 是马铃薯Y病毒重要的多功能蛋白，可以影响病毒生活史的多个方面，它具有HC-Pro/P3特异切割位点识别功能，在病毒基因组翻译、蛋白加工中发挥重要作用，同时参与病毒的复制和症状表达，促进病毒在植物体内细胞间移动和系统移动，抑制转录后基因沉默和病毒诱导的基因沉默[5-6]。南方番茄病毒是一种双链RNA(dsRNA)病毒，其基因组核苷酸序列全长为3 437 nt，含有2个部分重叠的开放阅读框，推测ORF1编码377个氨基酸的外壳蛋白(CP)，而ORF2编码762个氨基酸的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)[7-9]。STV为种传病毒，尚未发现其他传播机制，目前，对于STV的研究还处于初期阶段，对于其侵染番茄植株的分子机制及侵染症状尚不了解。酵母双杂交系统是植物病毒学研究中的重要手段，主要应用于病毒蛋白与寄主编码蛋白相互作用的研究，可以通过酵母双杂交系统筛选与PVYHC-Pro和STVRdRp基因相关的加工番茄内源基因。由于酵母双杂交系统可能出现假阳性现象，所以需要进行诱饵载体自激活试验，本研究利用以Sos恢复系统(一种不依赖转录激活机制的酵母双杂交系统)为原理的胞质酵母双杂交系统，构建PVYHC-Pro和STVRdRp基因的诱饵载体，并在酵母中进行自激活检测及毒性分析，为从加工番茄cDNA文库中筛选与PVYHC-Pro和STVRdRp互作的寄主因子以及研究PVY和STV的致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及试剂 温度敏感酵母突变株cdc25H、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α为笔者所在实验室保存。质粒pSos、pSos MAFB、pMyr MAFB、pMyr LaminC、pSos ColⅠ、pMyr SB，均购自Stratagene公司；T4DNA连接酶及PCR产物回收试剂盒均购于Promega公司；试验所需内切酶购自Fermentas公司；氨基酸、酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 基因与引物 根据笔者所在实验室已获得的PVY[2]和STV基因组全长序列设计引物，结合酵母表达载体pSos的阅读框和多克隆位点，在PVYHC-Pro上下游引物的5′端分别引入BamHⅠ/SalⅠ酶切位点，在STVRdRp上下游引物的5′端分别引入SalⅠ/SacⅠ酶切位点(表1)。引物合成和序列测定均由北京六合华大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆 以笔者所在实验室已经克隆、测序的pGEM-T-PVY HC-Pro及pGEM-T-STV质粒DNA为模板，利用引物HC-Pro F/HC-Pro R、RdRp F/RdRp R分别扩增HC-Pro和RdRp，扩增结束后，将5 μL PCR产物进行电泳，对剩下的扩增产物进行回收。

1.2.2 克隆载体和诱饵载体的构建与鉴定 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后与pGEM-T载体于4 ℃过夜连接。将连接产物转化EscherichiacoliDH5α，37 ℃过夜培养，挑取单菌落，37 ℃摇菌16 h，提取质粒DNA，双酶切鉴定正确的克隆载体进行测序。将测序正确的重组质粒pGEM-HCPro、pGEM-RdRp分别用BamHⅠ/SalⅠ、SalⅠ/SacⅠ双酶切，同时用相同的酶消化酵母诱饵载体pSos，回收目的片段，用T4DNA连接酶于4 ℃连接过夜，构建pSosHC-Pro、pSos-RdRp载体。

表1 试验所用的引物及序列

注：下划线表示在相应引物5′端引入酶切位点的序列位置。

1.2.3 酵母菌株cdc25H表型的验证 将Stratagene公司CytoTrap XR Library Construction Kit中的酵母菌株cdc25H划线于YPAD平板，分别于25、37 ℃孵育6 d，同时将酵母菌株cdc25H在4种单营养缺陷型[尿嘧啶缺陷型(Ura-)、亮氨酸缺陷型(Leu-)、色氨酸缺陷型(Trp-)、组氨酸缺陷型(His-)]SD/Glu培养基(指含有葡萄糖的SD培养基)平板上划线，在25 ℃下培养6 d，观察结果。

1.2.4 共转化及诱饵蛋白转录自激活活性的检测 将表2的不同质粒组合分别加入酵母感受态细胞中并混匀，再按照Stratagene公司CytoTrap XR Library Construction Kit所提供的方法进行共转化与激活作用检测试验。分别将10、100 μL转化酵母菌液涂布于SD/Glu (-UL)平板上，于 25 ℃ 培养 5 d，计算酵母感受态细胞转化效率，并将剩余转化酵母菌液1(对应表2中的第1组)涂布于SD/Glu(-UL)平板上，于 37 ℃ 培养6 d，观察是否发生温敏回复。分别将转化酵母菌液2～9(对应表2中的第2～9组)涂布于SD/Glu(Leu-、Ura-、-UL)平板上，25 ℃培养5 d后，随机挑取3个单菌菌落，分别用25 μL无菌水混匀，再分别取 2.5 μL 菌液划线于2个 SD/Glu(-UL) 和2个SD/Gal(-UL)平板上，每种平板分别放置于25、37 ℃下培养5 d，观察温度对菌落生长的影响。

表2 诱饵蛋白和对照检测质粒共转化组配

注：“-UL”指缺失尿嘧啶、亮氨酸2种氨基酸。下同。

2 结果与分析

2.1 克隆载体与诱饵载体的构建及鉴定

通过PCR扩增、克隆获得1 398 bp PVYHC-Pro和2 286 bp STVRdRp基因，并将相应的目的片段连接pSos，成功构建pSosHC-Pro和pSos-RdRp载体(图1)。

2.2 酵母菌株cdc25H表型的验证

将酵母菌株cdc25H在YPAD平板上划线，分别在25、37 ℃ 培养6 d。在25 ℃时菌落生长正常，在37 ℃时无菌落生成。同时，将酵母菌株cdc25H在4种单营养缺陷型(-Ura、-Leu、-Trp、-His)SD/Glu平板上划线，于25 ℃培养6 d，结果在4种单氨基酸营养缺陷型的平板上均不生长。结果表明，酵母菌株cdc25H表型正常，没有发生温度敏感回复突变，可用于后续试验。

2.3 酵母感受态细胞的制备和转化效率的计算

取75 μL酵母感受态细胞涂布于YPAD平板上，于37 ℃孵育 6 d 后发现没有出现酵母菌落，表明未发生温度敏感回复突变，可用于后续试验，根据表2中转化酵母菌液1可计算出酵母感受态细胞的转化效率为6.14×103/μg，将剩余转化酵母菌液1涂布于SD/Glu(-UL)平板上，于37 ℃孵育6 d，未发现酵母菌落生长，表明没有温敏回复发生，说明所制备的酵母感受态可用于酵母双杂交试验。

2.4 诱饵蛋白自激活作用的检测

将测序后证明构建正确的诱饵载体pSosHC-Pro及pSOS-RdRp按照表2中的配比转入制备好的cdc25H酵母感受态细胞后，发现25 ℃时均能够在SD/Glucose(-UL)平板上正常生长，分别随机挑取3个单菌落分别划线于2个 SD/Glu(-UL) 和2个SD/Gal(-UL)平板上，每种平板分别放置在25、37 ℃下培养5 d，对于诱饵蛋白pSosHC-Pro及 pSos-RdRp，在25 ℃时每种组合在SD/Glu(-UL)和SD/Gal(-UL)平板上均能生长，现象正常；在37 ℃时SD/Glu(-UL)平板上均不生长，在SD/Gal(-UL)平板上①、③、⑤生长现象正常，结果表明诱饵蛋白pSos-HcPro及pSOS-RdRp没有自激活作用(图2)，因此可见2种诱饵载体适用于该酵母双杂交系统，可以进行后续的cDNA文库筛选。

3 讨论

新疆由于水土光热资源丰富，使得加工番茄成为该地的主要经济作物。近年来，由于受栽培模式及气候等客观因素的影响，使得病毒病得以蔓延。通过对新疆加工番茄田间病毒检测发现，新疆加工番茄病毒病主要有CMV、ToMV、PVY、STV，这表明STV也已成为加工番茄种植不容忽视的主要病毒[10-11]。本研究将PVY、STV作为新疆加工番茄主要原有病毒以及新兴的主要病毒，研究PVY、STV与加工番茄的相互作用以及揭示其致病机制尤为重要。

酵母双杂交技术是在真核细胞调控转录中进行的一种高效敏感的研究蛋白与蛋白之间相互关系的技术[12]。近年来，酵母双杂交技术已成为植物病毒学研究中的主要手段，广泛应用于研究植物病毒蛋白与寄主编码蛋白之间的相互作用，大量应用于筛选与已知蛋白的候选互补蛋白或验证蛋白间相互作用方面[13-14]。研究认为，HC-Pro在病毒侵染过程中起至关重要的作用，利用酵母双杂交系统筛选加工番茄中与PVY HC-Pro互作的寄主因子，将有可能从加工番茄中分离鉴定出参与病毒沉默的寄主因子基因，有助于加工番茄防治病毒病的研究。STV作为新兴的加工番茄主要病毒，其侵染加工番茄的分子机制尚不清楚，利用酵母双杂交系统筛选与 STV-RdRp互作的寄主基因，将有可能弄清STV侵染植物的机制，为研究STV提供基础。

在利用酵母双杂交系统筛选文库验证及蛋白质间相互作用的过程中，诱饵蛋白的正确表达至关重要，一方面由于某些蛋白的表达可能会对酵母菌株有毒害作用，使其不能够在选择培养基上进行生长，影响后续筛选工作，另一方面某些诱饵蛋白本身就具有转录自激活活性，这些蛋白能够激活报告基因，使其能够表达，造成假阳性现象，因此，要进行诱饵载体的自激活和毒性验证，以此排除假阳性和假阴性现象。本研究构建了PVYHC-Pro和STV-RdRp基因的诱饵载体，通过研究显示这2个诱饵载体均无毒性或自激活作用，因此，构建完成的诱饵载体符合本试验的需要，为下一步从加工番茄cDNA文库中筛选与HC-Pro和RdRp相互作用的蛋白奠定了基础。