酵母双杂交技术应用进展

王 婷， 葛怀娜， 郭 宏

天津农学院动物科学与动物医学学院，天津300384

酵母双杂交技术应用进展

王 婷， 葛怀娜， 郭 宏∗

天津农学院动物科学与动物医学学院，天津300384

酵母双杂交技术是鉴定蛋白互作最有效和最广泛的分子生物学技术。该技术能直接作用于活细胞，检测细胞内蛋白质互作，具有成本低、易操作、可达到全基因组水平、能进行品种间的互作鉴定等诸多优点。较之传统的检测方法有明显优势，已在越来越多的领域得到应用。对酵母双杂交的技术原理以及应用进行了综述，介绍了该技术在发现新蛋白质、探究蛋白质功能、建立基因组蛋白连锁图、研究人类DNA文库和筛选药物作用位点等方面的重要应用，以期为该技术的广泛应用提供参考。

酵母双杂交；技术原理；应用

近年来，系统生物学领域的发展主要归功于科研人员在分子生物学研究中取得的重大突破，同时随着人类基因组计划的顺利完成，对于基因工程领域的探索已经从结构基因组研究迈向功能基因组研究时代[1]。作为一个重要的学科，功能基因组学主要的研究任务是将生物基因组中包含的全部基因进行正确的翻译和对相应的蛋白质功能进行研究，其中还包括未知的大量基因及其表达蛋白的功能探索[2]。核酸是生命体的遗传物质，而蛋白质是生命体所依赖的物质基础，核酸与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间存在着交互作用，而这种交互作用决定着生命体的基础生命活动。

酵母双杂交技术是研究蛋白之间相互作用的主要方法，该方法成本低、易操作、可达到全基因组水平，还能进行品种间的互作[3]，酵母双杂交技术在多项研究领域中具有重要地位和广阔的研究和发展前景。本文对酵母双杂交技术原理及在各领域的应用进展进行了综述，以期揭示酵母双杂交技术在功能基因组学中的重要作用。

1 酵母双杂交技术基本原理

科研水平的进步推进了生命科学领域的发展，相继出现了多种不同的生物技术研究手段，其中包括酵母双杂交技术的建立和广泛应用[2]。1989年，Fields等[4]建立了酵母双杂交体系，并将其应用于真核细胞的基因转录研究中，该研究发现真核生物存在着一种由两个相互独立的结构域组成的，并可与基因上游的转录起始位点特异结合的转录激活因子。这两个结构域相互独立、功能不同、互不干扰，同时又组成了一个完整结构来激活特定的基因表达，称为DNA特异性结合，这两个结构域分别标记为BD和AD[5]。除此之外，还包括一个具有BD结合域结合位点的人工合成的报告基因。在一般的酵母双杂交系统中，会构建一个被称为“诱饵”(bait)的含有已知蛋白X的基因序列及BD结构域序列的重组载体，还会构建一个被称为“猎物”(prey)的由未知蛋白Y基因序列与AD结构域序列构成的载体。如果bait和prey之间没有相互作用，BD和AD就不会与激活序列结合，报告基因也就不能被激活和表达；反之，在宿主细胞内，若bait和prey相互作用且同时表达，那么BD和AD就会与激活序列结合，下游报告基因也就被激活从而进行表达[6]。由此，蛋白质间相互作用的研究就可通过对报告基因的激活表达与否进行检测[7]。将两种重组载体分别转入两种酵母菌中，再将这两种酵母进行杂交、融合，以达到重组载体共转化的目的，提高了重组载体的转化效率。该技术从创立至今也在不断改进和发展，通过对BD和AD载体的改造、报告基因的增加，有效提高了筛选的真阳性率、降低了假阳性率。大量的实验结果证明，酵母双杂交技术已经应用于微生物、病毒乃至动植物等诸多领域，成为了研究蛋白互作的重要技术平台，为探究蛋白互作及蛋白功能提供了更多可能。

2 酵母双杂交技术的特点

酵母双杂交系统在分析蛋白互作时具有高效、敏感度高、受外部环境影响小、易于操作、应用范围广、简单快捷等诸多优点，但是该技术也存在一些局限性。酵母双杂交技术分析蛋白质间的相互作用定位于细胞核内，而糖基化、二硫键的合成等对蛋白的加工却需要在胞浆内完成，蛋白质间的相互作用许多都依赖于此类翻译后的加工，所以此技术不适用于某些细胞外蛋白以及细胞膜受体蛋白。

酵母双杂交技术一般会出现两种假阳性的情况。一种情况是由于检测虽在活细胞内进行，并且在某种程度上可以真实地反应细胞内状态，但细胞内的一些蛋白质本身就具有激活转录的功能，酵母表达了那些只与BD结构域结合而缺少AD结构域的蛋白；另外一种情况是一些蛋白质的表面有多重蛋白的低亲和力区域，这些区域会与其他蛋白作用形成结构稳定的复合物，这些情况都可能引起报告基因的表达。

鉴于实验中出现的诸多问题，针对酵母双杂交技术出现假阳性的问题，研究人员进行了各种尝试和改善，如增加报告基因的个数、用杂交代替共转等手段有效降低了假阳性的发生，希望能更好地推进酵母双杂交技术在哺乳动物领域的研究。

3 酵母双杂交技术的应用

酵母双杂交技术在研究和鉴定蛋白质互作方面起着重要的作用，加之有大量研究结果表明酵母双杂交技术在诸多领域都得到了应用和深入发展。应用该技术已发现了大量新蛋白及蛋白质的新功能，从而为建立基因连锁图谱丰富了生物学信息，利用基因图谱可以发现大量药物重要的作用靶点，推动医药行业在分子生物学领域的发展。因此，该技术在各个研究领域中都有广泛的应用。

3.1 发现新蛋白质及蛋白质的新功能

利用酵母双杂交系统对动植物不同组织及不同表达时期的cDNA文库进行筛选可以发现大量新蛋白质，这是目前该技术最为重要的应用。郑海舰等[8]利用酵母双杂交技术，用牛肌肉生成抑制素蛋白作为诱饵蛋白筛选牛肌肉cDNA文库，从而发现了参与肌肉形成的新蛋白，为阐明牛肌肉形成的机理提供了依据。Tham等[9]利用酵母双杂交技术发现埃及伊蚊的CPB1蛋白与登革热病毒DENV2 E蛋白具有互作关系，并且CPB1蛋白对伊蚊中肠细胞中的病毒积累和释放起调控作用。埃及伊蚊是登革热病毒的主要传播媒介，这一发现对于控制登革热病毒的传播具有重要意义。Benoit等[10]用酵母双杂交方法将外周蛋白亚型Per-61作为诱饵蛋白，对小鼠脑组织cDNA文库进行筛选，发现外周蛋白还具有调控亚细胞分布和参与囊泡运输、信号传导、DNA/RNA加工、蛋白折叠和线粒体代谢等功能。Cao等[11]通过建立高质量的小麦cDNA文库，利用酵母双杂交系统，将小麦春化作用调控因子TaVRN-A1蛋白的基因作为Bait，筛选出互作蛋白TaSOC1和TaSVP1。除利用该技术发现新蛋白以外，研究人员还将其用于生物学上已知蛋白的功能研究，对已知蛋白的新功能进行探索，可有效筛选出已知蛋白的结构域，并对其功能进行深入探究。

3.2 建立基因组蛋白质连锁图谱

随着人们对生命活动研究的逐渐深入，越来越多的研究已经达到基因水平，加之基因文库的建立与日趋完善，更多对生命活动起到调控作用的蛋白质或结构域被确定。这些蛋白质源自基因组中具有编码蛋白质功能的基因，这些基因在功能上也有着相互关联，这对人们了解各种重要的生命活动有着非常重要的意义[12，13]。Waaijers等[14]以几种蛋白质作为诱饵，利用酵母双杂交对人类基因组文库进行筛选，建立了人基因组蛋白质连锁图谱。通过酵母双杂交方法，确定了线虫中超过200个蛋白质的互作结构域，丰富了蛋白质的互作网络，建立了基因组蛋白质连锁图谱[15]。Yuan等[16]利用酵母双杂交技术绘制了HBX蛋白的互作组图谱，发现了9个HBX新的互作对象。利用酵母双杂交和Pull-down技术还发现了与基孔肯雅热病毒互作的12个新蛋白并绘制了基孔肯雅热病毒非结构蛋白功能域的基因网状图[17]。刚地弓形虫MIC2蛋白是一种调控黏附的蛋白质，但它的作用机制尚不清楚，利用酵母双杂交系统，确定刚地弓形虫MIC2蛋白与宿主整合素样蛋白A结构域结合，阐明了刚地弓形虫黏附宿主的作用机制[18]。Simona等[19]通过酵母双杂交和Pull-down技术发现HEN1蛋白空间上与HYL1蛋白及DICER样蛋白发生互作，完善了植物RNA甲基转移酶的功能图谱。Katsogiannou等[20]通过酵母双杂交系统，筛选出了226个与热休克蛋白HSP27互作的蛋白质，并绘制了HSP27的蛋白网络图谱，发现HSP27蛋白参与新细胞的生理过程，如DNA修复、可变剪切，并提出了新的抗癌靶点。可见酵母双杂交系统在各个领域中都发挥着重要的作用，不断丰富和完善蛋白连锁图谱，为进一步深入研究基因的功能结构提供了可能。

3.3 研究人类DNA文库，筛选药物作用位点

利用酵母双杂交技术可对人类cDNA文库进行筛选，确定相关作用位点，使人们对药物作用位点掌握的更加精确，为疾病的治疗找到新的方向。张菁等[21]通过酵母双杂交技术对正常人脑cDNA文库中筛选与人DND 1相互作用的蛋白质，并对筛选出的蛋白质进行相关功能的初步分析，为进一步研究人DND 1的功能及信号通路奠定了基础。李芬等[22]建立了以正向转录延伸因子(p-TEFb)为靶点的抗 HIV药物快速高通量筛选模型，并运用此模型筛选抗艾滋病中药。Zhao等[23]对人胎儿脑cDNA文库的筛选发现了激活蛋白原蛋白。Dengue病毒是一种可导致黄热病、肝炎等疾病的病毒，它依赖于RNA聚合酶NS5和拓扑异构酶NS3的帮助进行RNA复制。利用酵母双杂交系统找到了参与这些RNA复制的蛋白质的结构域。如果能找到相应的药物阻断这些蛋白质之间的相互作用，就可干扰RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的[24]。Julie等[25]利用酵母双杂交方法，筛选到HIV-1 Vpr蛋白的胞内单结构域抗体作用靶点。Freitas等[26]用酵母双杂交技术确定疾病诊断和治疗靶点，发现曲古抑菌素A可通过与磷酸酶1形成复合物，并利用该复合物作为治疗癌症的靶药物。甲型流感病毒H1N1编码的NS1(非结构性蛋白)可通过与胞内蛋白CPSF30的结合抑制前体mRNA 3′端的加工，因此CPSF30的结合位点可能作为治疗该病药物的靶点。Kong等[27]通过利用酵母双杂交系统对30种中药进行筛选，找到了4种能够强烈抑制NS1-CPSF互作的药物，其中包括双黄连口服液。Vielemeyer等[28]将抗原的几个可变区作为bait，筛选高复杂度的cDNA文库，将获得的全部结果进行测序并统计分析，将Prey片段按效率高低进行排序。通过大量获得的片段确定该抗原的互作结构域，这说明酵母双杂交技术可作为鉴定抗体的结合位点及其具体目标抗原决定簇的有效手段。Li等[29]利用酵母双杂交系统，确定乙型肝炎病毒X蛋白和细胞色素C氧化酶Ⅲ的互作，并精确绘制出各结构域的图谱。大量的实例说明酵母双杂交技术可有效筛选药物靶点，推动了医药科研领域的发展。

4 展望

酵母双杂交技术的提出距今已20多年，已在发现新蛋白质及蛋白新功能、建立基因组蛋白连锁图谱、研究人类DNA文库和筛选药物作用位点等方面发挥了重要作用，明确了多种蛋白质之间的相互作用。在此基础上，又衍生出酵母单杂交技术、酵母三杂交技术、核外双杂交技术、哺乳动物杂交技术和酵母的反向杂交技术等，为了解探究生命活动中蛋白质之间重要、庞杂的互作关系提供了可能。酵母双杂交技术从建立至今不断被完善和改进，因此该技术必定会在更多领域的蛋白质研究中发挥更大的作用。

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Progress on Application of Yeast Two-hybrid Technique

WANG Ting，GE Huai-Na，GUO Hong∗
College of Animal Science and Animal Medicine，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China

Yeast two-hybrid system is one of the most powerful and widely used method to detect protein-protein interaction in living cells.Yeast two-hybrid technique is cost-effective，easy to operate，can reach the whole-genome level，and identify the interaction between different varieties.Compared with the traditional detected method，it has obvious advantages and has been applied in more and more fields.In this paper，the yeast two-hybrid technology principle and application were reviewed，including the applications on discovering new protein and proteins'new function，setting up the protein linkage map，studing of human genome DNA library，screening target for drug，and so on.The paperwas expected to provide reference for the application of yeast two-hybrid system.

yeast two-hybrid；technical principle；application

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.05.12

2015-04-24；接受日期:2015-06-04

天津市自然科学基金(11JCZDJC17600)资助。

王 婷，硕士研究生，研究方向为动物胚胎工程与转基因。E-mail:378545634＠qq.com。∗通信作者:郭 宏，教授，博士，研究方向为动物胚胎工程与转基因、分子生物学和动物育种。E-mail:guohong64＠163.com