羊胚胎移植技术及其应用

2018-10-12瞿静雯尹修远李拥军

现代农业科技 2018年16期

瞿静雯　尹修远　李拥军

摘要胚胎移植，又称借腹怀胎、受精卵移植，是通过超数排卵技术获得品种优良母畜的早期胚胎，同时对受体母畜进行同期发情处理，使其处于发情期的同一阶段，将早期胚胎移植到生理状态相同的受体母畜生殖道或子宫内，使之继续发育成独立个体的生物繁殖技术。胚胎移植是继人工授精技术之后的又一项加快家畜扩大繁殖的先进技术，几十年来在羊纯种繁殖和快速扩繁等生产中得到了广泛的应用。本文就羊胚胎移植中的技术环节及其应用现状进行讨论，以期对该项技术在生产中的规范应用提供一定的理论指导。

关键词胚胎移植；羊；技术环节；应用现状

中图分类号 S814.8 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）16-0205-03

Technology and Application of Sheep Embryo Transfer

QU Jing-wen 1，2 YIN Xiu-yuan 1，2 LI Yong-jun 1，2 * GUO Hai-yan 1，2 WANG Qiang 1，2

（1 Animal Science and Technology College，Yangzhou University，Yangzhou Jiangsu 225009； 2 Key Laboratory for Animal Genetic，Breeding，Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province）

Abstract Embryo transfer，which called abdominal pregnancy and transplant fertilized eggs，is the early embryo of superior female by superovulation technology.At the same time，the recipient females are processed to make them in the same stage of estrus.The early embryos are transplanted to the genital tract or womb of the same receptor female in the same state physiological status，allowing them to continue to develop into individual.Embryo transfer is another advanced technology that accelerates the expansion of livestock after artificial insemination technology，which has been widely used in sheep breeding and rapid propagation in the past decades.This paper discussed the technical process of sheep embryo transfer and its application status，so as to provide some theoretical guidances for the standardized application of the technology in production.

Key words embryo transfer；sheep；technical process；application status

胚胎移植技术是基于人类对哺乳动物个体发生、发育、繁殖规律的认识，通过大量的试验研究和生产应用，逐渐发展起来的一项先进的生物技术[1]。早在1890年，Walter Heape教授在英国剑桥大学首次通过胚胎移植成功使比利时母兔产出了安哥拉仔兔[2]，这一举措引起了广泛关注。随后，以家兔、鼠为研究对象的胚胎移植技术得到广泛应用，但以牛、羊等草食性动物为研究对象的胚胎移植技术起步较晚。

我国胚胎移植技术的研究和应用起步较晚，很长一段时间内，我国胚胎移植技术都处于试验阶段。直到20世纪60年代，家兔胚胎移植技术才获得成功，随后这一技术在猪、马、牛、羊等中大型家畜上应用也成功获得后代，这对加快良种化进程、加速扩繁、品种选育和品种培育等繁殖技术起到重要作用[3]。随着社会经济的发展，肉羊产业呈现出欣欣向荣的景象，社会需求量的增加，对优质种羊的需求也进一步增加，少量进口的优质种羊难以满足市场的需要。因此，胚胎移植技术亟须得到广泛应用。

本文阐述了羊胚胎移植过程中的技术环节及应用现状，以期为提高母羊繁殖力提供一定的借鑒，使我国的肉羊产业更快地向商业化方向迈进。

1 技术环节

1.1 供体羊和受体羊的选择

1.1.1 供体。选择的供体羊应具有品种优良、生产性能好、遗传性稳定及无不良遗传疾病和传染性疾病等优点。此外，供体羊应选择繁殖机能正常，已证明对超数排卵反应较好的母羊，年龄以2～5岁为宜，青年羊应在8月龄以上[4]。

1.1.2 受体。选择的受体羊应健康、繁殖性能良好、无不良遗传或传染性疾病、母性好、产奶量高、体型较大的母羊，年龄1～5岁，以产过1～3胎为宜。受体羊的年龄应与供体山羊较为接近，相差1岁之内为宜，供体羊与受体羊的比例为1∶15～20。

1.2 供体的超数排卵

在母畜发情的适当时期，一般在发情后期，通过注射外源促性腺激素，使母畜卵巢比自然发情时有更多的卵泡发育并排出的过程，称为超数排卵。羊一般通过以下几种方法进行超数排卵。

1.2.1 FSH+LH法。发情周期的14～16 d任意一天开始，连续3 d，每天2次，间隔12 h，递减肌肉注射FSH，最后一次注射FSH后12 h肌肉注射LH，24 h后试情配种。有研究表明，FSH总剂量在7.5～11.5 mg/只、LH剂量在200 IU/只时超排效果较好[5]。

1.2.2 FSH+PG法。发情周期的14～16 d任意一天开始，连续3 d，每天2次，间隔12 h，递减肌肉注射FSH，总剂量为7.5～11.5 mg/只，最后一次注射FSH的同时注射PGF2α 2 mL，注射FSH后1～2 d即发情排卵。试情配种或输精2次，每次间隔12 h，同时注射LH 100～150 IU，增加受精率[6]。

1.2.3 FSH+CIDR法。在发情周期14～16 d的任意一天给供体羊使用进口CIDR阴道埋置，以此日为第1天，从第14天开始连续3 d，每天2次，等量注射FSH，每次2 mL，在最后一次注射FSH时取出CIDR，取出后1～2 d即发情排卵。试情配种或输精2次，每次间隔12 h，在第0天和最后1 d配合注射孕酮2 mL[7]，增加受精率。

1.3 受体的同期发情

绵羊和山羊同期发情方法相同，只是剂量上存在差别。同期发情的方法包括延长黄体期和缩短黄体期2种方法。其中，延长黄体期法是孕激素通过抑制卵泡期的到来而延长黄体期，在合适的时间同时停止使用外源激素，而达到同期发情的效果。处理方法有皮下埋植、孕激素阴道栓法、口服法等。而缩短黄体期法是前列腺素通过溶解黄体降低孕酮水平，人为终止黄体期，使受体母羊提前发情排卵而达到同期发情的效果[7]，发情同步差在24 h之内。

1.3.1 皮下埋植。将3 mg甲基炔诺酮装入多孔的塑料细管中，利用套管针或专门的埋植器埋于母羊耳背皮下，可在埋植之前注射2～4 mg雌二醇加速自然黄体的消退，经过数天后取出，过2～3 d即可发情[8]。皮下埋植法操作简单、高效、成本低。

1.3.2 孕激素阴道栓法。羊同期发情中以阴道栓法最为常见。取3 mg甲基炔诺酮溶解于色拉油中，用海绵浸润，在发情周期的任意一天，利用阴道扩张器，将浸入孕激素溶液中的海绵送入阴道，细绳暴露在阴门外，14～16 d后拉住细绳将海绵栓取出，2～3 d后即可发情排卵。为了提高发情率，取出海绵栓后肌肉注射一定量前列腺素[9]。

1.3.3 口服。每日将12 mg甲地孕酮均匀拌于每头发情母羊所食用的饲料中，保证采食后连续投喂数天，绵羊14～16 d，山羊18～20 d，停药不久即会发情[10]。

1.3.4 前列腺素法。前列腺素法为最简单的同期发情方法，在繁殖季节使用效果最佳。肌肉注射进行同期发情，使用二次注射法，每次剂量为10～20 mg，2次间隔时间为11～12 d。大量研究表明，一次注射法同期发情效果不明显[11]。生产上常使用氯前列腺烯醇进行发情处理。

1.4 胚胎的收集

胚胎的采集是胚胎移植的关键环节技术之一，羊胚胎移植通常在桑葚胚至囊胚期进行胚胎收集和移植。胚胎收集时间要根据胚胎发育情况来确定，一般在配种后3～4 d发育至桑葚胚，6～7 d发育至囊胚期。胚胎收集分为手术法和非手术法2种。在绵羊、山羊中，由于试验动物子宫角特殊的解剖结构，常使用手术法进行采胚。

1.4.1 手术法。供体母羊冲胚前禁水、禁食12～24 h[12]。手术在手术室进行，维持手术室温度在20 ℃左右，肌肉注射2%静松灵0.5～0.8 mL进行麻醉[13]，所有手术器材都应进行无菌处理。将供体羊仰卧保定，使之呈前低后高的状态，沿腹中线两侧离乳头2.5 cm左右处进行刮毛处理，用碘酒棉球进行术部消毒后做一切口，切口大小以能拉出子宫角和输卵管为宜[14]。

当确定受精卵还处于输卵管时，用带有磨钝针头的无菌注射器刺入子宫角尖端，每侧输卵管冲胚液用量10 mL左右，从输卵管伞部接取胚胎液。当确定所有受精卵已进入子宫角内时，用止血钳在子宫角基部穿孔，插入冲胚管，注入适当空气，使气囊封阻子宫腔为宜；然后用无菌注射器注入冲胚液30～50 mL，再由此导出胚胎液，两侧子宫角冲胚完毕后，放出一部分气体，将冲胚管抽至子宫体内，用10 mL无菌注射器注入溶解有320万IU青霉素和100万IU链霉素的生理盐水10 mL，冲胚完毕后逐层缝合，将子宫体送入腹腔，防止发生子宫黏连。冲胚后2 d肌肉注射前列腺素0.4～0.6 mg以溶解卵巢上的黄体，以便下次发情周期的发生[15]。

1.4.2 非手术法。将供体羊伏卧保定在保定架上，使之呈前低后高的状态，于外阴部周围剪毛、洗净、消毒，用0.05%新洁尔灭溶液冲洗阴道，排净洗液（其他所用器械均按常规消毒）。借助开腟器，用人医用的子宫颈钳夹住子宫颈口的凸起皱褶，将子宫颈缓慢向外牵引至阴门附近，由助手固定子宫颈钳，术者将左手食指深入阴道，右手持预先套好导管的探针（导管由兽用中号套管针改制，探针由人医用子宫探针或胆囊探针改制），使前端稍呈弯曲，在左手食指辅助下，沿着子宫颈管螺旋形的内腔缓慢向深处插入。套有导管的探针通过整个子宫颈管后（深5～8 cm，阻力消失），即將探针略偏向一侧继续推进2～3 cm。拔出探针，从导管内插入采卵管（用人医小儿胃管改制），采卵管即达该侧子宫角顶端（深约30 cm）。随后用10 mL无菌注射器吸取加温至38～39 ℃的1×PBS（磷酸盐缓冲液）6～8 mL，自采卵管注入子宫角，立即回收冲胚液。回收时微微前后转动采卵管，以防孔道被子宫黏膜堵塞。如此反复冲洗3次[16]。

1.5 胚胎的检查和评定

冲胚液回收之后，尽快在20 min内置于体视镜下检查收集到的胚胎，并用检胚细管将胚胎移至新鲜培养液滴中，移胚时注意动作缓慢，防止胚胎跑飞。通过体视镜来对胚胎形态进行质量分级鉴定，即将体视镜调至80～100倍，观察胚胎形态、卵裂球的大小与均匀度、透明带的间隙、变性等情况，只有形态、结构正常的胚胎才能进行移植[17]。一个理想的胚胎，其发育阶段应与回收时达到的胚龄保持一致，胚胎大小均匀，结构紧凑，透明带均匀一致，胚内细胞间的界限清晰可见，没有不规则分布的空泡，无细胞碎片。

1.6 胚胎的移植

胚胎的移植是胚胎移植技術的最后一个关键技术环节。胚胎的移植技术决定移入受体的早期胚胎能否顺利发挥其遗传潜能而发育成一个完整后代。与采胚方法相同，羊胚胎移植也分为手术法和非手术法2种。移植时注意观察受体羊两侧卵巢的红体（排卵点）的分布情况，卵巢上无红体或红体发育不健全的受体羊不作为羊胚胎移植受体。

1.6.1 手术法。常使用含5%胎牛血清的D杜氏磷酸缓冲液移植[18]。同期发情处理后的受体母羊限水、禁食24 h进行，手术前对手术部位剪毛、剃毛、消毒。肌肉注射2%静松灵0.5～0.8 mL进行麻醉，手术器械等用0.1%新洁尔灭液浸泡30 min常规消毒，烘干待用。移植方法同胚胎采集方法。为了使胚胎发育阶段与其应所处的生理状态一致，应将16-细胞之前的细胞移入输卵管，而桑葚胚以后的胚胎移入子宫角前1/3，提高胚胎成功附植到受体子宫而发育成完整个体的可能性[19]。

1.6.2 非手术法。在受体发情后6～12 d，通过人医用的子宫探针或胆囊探针作导管的引子，使探针前端稍弯曲，导管便能顺着子宫颈螺旋形管道前进，把胚胎注入子宫颈内[16]。此法操作技术繁琐复杂，需反复实践练习。

2 羊胚胎移植的应用现状

胚胎移植技术是继人工授精之后最具有应用价值的生育繁殖技术，能够大大提高繁殖效率，充分发挥良种母羊的繁殖能力，保证优良品种的大量扩繁。近年来，我国普遍从国外进口优质胚胎来解决我国优质种羊品种短缺问题，各级畜牧兽医技术推广部门及畜禽生产公司从澳大利亚、新西兰、德国等畜牧业发达国家引进大量优质羊胚胎，用于扩繁优良品种种群体系，收效显著。我国国家科技攻关项目“肉羊舍饲、半舍饲养殖关键技术研究与产业化示范”将羊的胚胎移植作为关键技术之一，进行了产业化试验与示范；同时，“十五”期间，在内蒙古等地还实施了绵羊的“万枚胚胎工程”项目。这些项目的实施和完成，为我国肉羊产业的发展作出了突出性贡献。但是，目前我国羊胚胎移植应用现状与发达国家相比，还不够成熟，主要体现在以下几个方面。

（1）胚胎移植是一项比较复杂的生物繁育技术，要求项目管理人员及操作人员具备相当高的理论知识水平以及丰富的实践操作经验。目前，我国掌握高水平羊胚胎移植技术的专业人员非常匮乏，除了高校、科研院所及专业移植公司有少量专业人员掌握该项技术外，基层畜牧推广单位及人员很少具备此项技能，限制了羊胚胎移植技术的推广和应用。因此，加强基层专业技术人员的培训力度，让更多的基层人员掌握胚胎移植技术，使胚胎移植技术在优秀种羊的引种、扩繁、品种改良与育种等方面发挥关键作用[20]。

（2）羊在胚胎移植后，营养水平不精细、饲养条件粗放、环境卫生不达标，是导致成功率低的主要因素。因此，应加强对饲养人员的技术指导，培养饲养员科学的饲养管理意识，保证羊胚胎移植后饲养环境清洁、舒适，并设计科学的饲养配方，给予充足的营养，提高胚胎发育成完整个体的潜力，从而提高移植率和产羔率。

（3）胚胎移植花费较高，整个流程耗费大量的人力物力财力，主要包括购买试剂耗材、大型实验仪器、供体羊受体羊的购置及相关人员的培训指导费。因此，国家有关部门及地方政府进一步加大胚胎移植技术方面的财政补贴补助，落实支持畜牧业发展的项目规划，将有利于此项技术的推广和应用，推动羊品种改良进程[20]。

（4）随着肉羊产业的迅速发展，胚胎移植技术在种羊生产上的应用不断推进，目前，有不少地方对胚胎移植市场的监管不到位，导致品种恶意炒作、假冒伪劣现象屡有发生。因此，国家畜牧兽医行政主管部门应肩负起责任，加强市场监管，制定相关规定，严厉打击假冒伪劣品种，使羊胚胎移植市场能够健康、高效、持续地发展。

3 结语

随着我国居民生活水平不断提高，传统的肉羊饲养和繁育模式难以满足人民对肉羊需求。羊胚胎移植技术的诞生和广泛应用，改变了传统的繁殖和生产方式，提高了养羊业的生产效率，推动了现代化畜牧业的发展，保障了优质、足量的羊肉供应。羊胚胎移植技术的规范应用，必将对我国肉羊生产的持续发展产生深远的影响。

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