褐杆菌L2的抑菌活性与抑菌蛋白研究❋

蔡秀磊， 单 虎， 于 敏，张晓华

(1.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003; 2.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109)

目前，细菌性病害是阻碍水产养殖业发展的主要因素，不但会给水产养殖业造成巨大的经济损失[1]，而且由于抗生素滥用也导致了严重的耐药性和食品安全问题[2]，因此寻找安全有效的科学防控手段一直是我们关注的热点。在研究中已经发现很多海洋细菌(如玫瑰杆菌类群的菌株)可以抑制病原菌的生长，并能产生多种抑菌活性物质，具有潜在的应用前景。褐杆菌是由Martens等[3]于2006年报道的新属，属于变形菌门，α-变形菌纲，红杆菌目，红杆菌科。目前褐杆菌属共包括8个种，据报道该属的许多菌株对弧菌等水产养殖病原菌均具有较强的抑菌活性[4]，且能通过多种方式从外界获得营养物质并保持生存优势[5]，逐渐受到科研人员的关注。2012年，Cude等发现褐杆菌(Phaeobacter)Y41可以产生蓝色色素，并能产生抑菌活性物质显著抑制鳗弧菌的生长[6]。我们从养殖水体中分离到一株能够广泛抑制病原菌的褐杆菌L2，在确定其分类学地位的基础上，对其抑菌活性及抑菌活性物质进行了初步的分析与鉴定。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌株L2为本实验室自养殖水体中防污附钢片的微生物粘膜中分离得到的菌株，抑菌谱测定实验中所用的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均由青岛农业大学预防兽医实验室分离并保存，鳗弧菌和芽胞杆菌由本实验室分离并保存。菌株L2、鳗弧菌和芽胞杆菌采用MA培养基在28 ℃进行培养，其他指示菌采用LB 培养基在 37 ℃进行培养。所有菌株以含15%甘油的MA或LB培养基保存于本实验室-80 ℃冰箱。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株L2的 16S rRNA基因测序及序列分析 采用酚氯仿抽提法[7]提取菌株L2的基因组DNA，并以此为模板采用通用引物B8F和B1510[8]扩增菌株L2的16S rRNA基因。其PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测、纯化、连接到pUCm-T载体后委托上海英俊测序。将测序所得的16S rRNA基因序列与韩国标准菌数据库(www.ezbiocloud.net)进行比对，用序列综合分析软件MEGA7.0[9]以neighbour-joining (NJ)、maximum-likelihood (ML)和maximum-parsimony (MP) 法构建菌株L2及相近菌株16S rRNA基因的系统发育树。

1.2.2 菌株L2抑菌谱测定 自-80 ℃冰箱将菌株L2复苏到MA平板上，培养48 h，挑取单菌落转接至5 mL MB培养基中，置于28 ℃振荡培养箱中以170 r/min转速振荡培养过夜。各指示菌经复苏和振荡培养过夜后，按1∶100的比例与LB半固体培养基混合、倒板，并采用牛津杯法检测菌株L2对各指示菌的抑菌活性。每孔中加入菌株L2的发酵液各50 μL，并选取氨苄青霉素、卡那霉素和四环素这三种抗生素作为阳性对照。每片药敏片的抗生素含量分别为：氨苄青霉素10 μg、卡那霉素30 μg和四环素30 μg。培养24 h后观察菌株L2和药敏片的抑菌活性，除去牛津杯的直径或药敏片直径计算菌株L2及3种抗生素的抑菌圈直径。

1.2.3 不同培养时间对菌株L2的生物量、抑菌活性的影响 将过夜培养的L2发酵液以1∶100的比例转接入5 mL MB培养基，置于28 ℃振荡培养箱中以170 r/min转速分别振荡培养12、24、36、48、60和72 h后，收集发酵液，使用可见光分光光度计测定OD600值，测定不同培养时间菌株L2的生物量；用低温高速离心机在4 ℃下将发酵液12 000 r/min 离心10 min，上清经0.22 μm 滤膜过滤除菌后，以牛津杯法检测其对鳗弧菌(Vibrioanguillarum)VIB72的抑菌活性强弱。

1.2.4 分步硫酸铵沉淀法对菌株L2胞外蛋白的初步纯化与抑菌活性检测 采用平板玻璃纸覆盖法[10]制备菌株L2的胞外产物。采用分步硫酸铵沉淀法对菌株L2的胞外蛋白进行初步纯化。根据胞外产物的体积缓慢加入硫酸铵并搅拌，使其饱和度达到20%，待硫酸铵完全溶解后，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，收集蛋白沉淀。重复以上步骤，所得上清分别依次加入硫酸铵使其饱和度达到40%、60%及80%，离心收集蛋白沉淀。所得的蛋白沉淀以0.01 mol/L PBS溶液溶解后以相同溶液透析24 h，从而按照不同硫酸铵饱和度将胞外蛋白初步分离为20%、20%～40%、40%～60%和60%～80% 4部分。以Bradford法测定各部分蛋白的含量，并以鳗弧菌VIB72为指示菌，采用牛津杯法检测4部分胞外蛋白的抑菌活性。

1.2.5 菌株L2胞外蛋白的胶内抑菌活性检测与活性蛋白的质谱鉴定 取15 μL经80%硫酸铵饱和度沉淀所得的样品，加入5 μL 4×SDS上样缓冲液混匀，用制备的5%浓缩胶、12%分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳时平行进行2个重复，电泳结束后一块胶用考马斯亮蓝R-250染色，一块胶用于胶内活性检测。

蛋白样品经电泳后，将含有待测样品的胶条切下，放置于经灭菌处理的平板中，在超净台中倒入30 mL灭菌三蒸水冲洗胶条，重复3次后，将胶条置于含有灭菌三蒸水的平板中，打开超净台内的紫外灯灭菌10 min。轻轻倒掉三蒸水，将胶条平置于另一个干燥的平板中待用。在灭菌的锥形瓶中加入10 mL的0.5% MA半固体培养基，待其冷却至50 ℃左右时，加入100 μL培养过夜的菌株VIB72(约108cfu/mL)并迅速摇匀、倒板，确保培养基均匀覆盖在胶条上。待培养基凝固后，正置于28 ℃培养箱内，于12 h后观察结果。

延长电泳时间，使蛋白条带更好的分离后，切下有抑菌活性的蛋白条带，置于离心管中，经双蒸水冲洗后，加入胶内消化脱色液清洗2次，并用乙腈脱水至胶粒变白后真空抽干乙腈，加入二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)孵育后，加入0.1 μg/μL的酶储液对胶块进行消化过夜后并以终浓度0.1% 的三氟乙酸(TFA)溶液终止消化[11]，取部分样品委托上海华大基因采用MALDI Tof/Tof (Thermo Q-Exactive 质谱仪)进行LC-MS/MS鉴定，并采用软件Mascot 2.3.01进行数据搜索、比对。

2 结果

2.1 菌株L2的 16S rRNA基因测序结果

通过细菌通用引物对菌株L2的16S rRNA 基因进行扩增，得到1 482 bp的序列。经过与韩国标准菌数据库(www.ezbiocloud.net)进行比对，该基因与抑菌褐杆菌(Phaeobacterinhibens)DSM 16374T相似性最高，为99.86%，与P.gallaeciensisDSM 26640T相似性为99.57%，其次是LeisingeradaeponensisDSM 23529T和L.methylohalidivoransDSM 14336T，相似性为97.84%。用软件MEGA 7.0对菌株L2及相近菌株的16S rRNA 基因进行系统发育分析(见图1)，结果显示菌株L2与P.inhibensDSM 16374T亲缘关系最近，聚为一簇。由此可初步判定菌株L2为抑菌褐杆菌。

2.2 菌株L2的抑菌谱

采用牛津杯法进行菌株L2的体外拮抗实验，菌株L2可以抑制本实验中选用的所有病原菌，其中对金黄色葡萄球菌PMJ10-1、TTB1-1和鳗弧菌VIB72的抑制效果最强，其抑菌谱见表1。氨苄青霉素、卡那霉素、四环素均无法抑制所有选取的病原菌，部分菌株具有较为广泛的耐药性，而菌株L2对病原菌的抑菌活性及抑菌范围明显强于这3种抗生素。在后续研究中，我们均选用能被菌株L2显著抑制的鳗弧菌VIB72作为指示菌。

(“●”表示该节点与采用ML、MP法的结果一致；“○”表示该节点与采用ML法的结果一致。Closed circles indicate that the corresponding nodes are also recovered in tree generated with the maximum-likelihood and maximum-parsimony algorithms; Hollowed circles indicate that the corresponding nodes are also recovered in tree generated with the maximum-likelihood algorithm.)

图1 菌株L2与相近菌株16S rRNA基因构建的NJ系统发育树
Fig. 1 Phylogenetic tree of strain L2 based on 16S rRNA sequence by neighbour-joining method

2.3不同培养时间对菌株L2的生物量和抑菌活性的影响

菌株L2在培养48 h后，其生物量和胞外产物总蛋白量最高(见图2)，培养72 h其生物量和胞外产物总蛋白量略有下降，但下降幅度不大，培养96 h后下降明显。而菌株L2在培养24、48、72、96 h之后的胞外产物均具有抑菌活性，但在72 h时其抑菌活性最强。这表明菌株L2在培养48 h后，其生长进入稳定期，且随着胞外产物的逐步积累，在培养72 h时产生的抑菌物质活性最强。因此，我们在后续实验中采用平板玻璃纸覆盖法培养72 h的方法对菌株L2的抑菌物质进行研究。

2.4 分步硫酸铵沉淀法对菌株L2胞外蛋白的初步纯化与抑菌活性检测

分步硫酸铵沉淀法可以初步将L2的胞外蛋白分离，分别得到了硫酸铵饱和度20%、20～40%、40～60%和60～80%的沉淀产物。经低温高速离心后，不同的硫酸铵饱和度均有蛋白析出，但各饱和度得到的蛋白量不同，且20%饱和度析出的蛋白为乳白色，其余3个饱和度析出的蛋白呈浅棕黄色。经Bradford法测定蛋白浓度，其中饱和度为60%～80% 得到的蛋白量最小，40%～60%得到的蛋白量最大。抑菌活性检测结果发现，除了20%硫酸铵饱和度析出的蛋白未检测到抑菌活性外，其它3个组分均有抑菌圈的产生，且40%～60%硫酸铵饱和度析出的蛋白抑菌活性最强，这可能与该组分的蛋白浓度最高有关(见表2)。由此可见，分步硫酸铵沉淀法可以初步对L2的胞外蛋白进行分离。为了获得最大量有活性的胞外蛋白，采用饱和度为80%的硫酸铵沉淀法提取L2的胞外蛋白，进行下一步的实验验证。

表1 L2对不同指示菌的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of strain L2

Note:①Strain no；②Strain name；③Diameter of inhibition zone of L2；④Diameter of inhibition zone of AMP；⑤Diameter of inhibition zone of kan；⑥Diameter of inhibition zone of TET.

(a. 不同培养时间对生物量的影响；b，不同培养时间对抑菌活性的影响。a. effect of culture time on the biomass of strain L2; b. effect of culture time on the antibacterial activity of strain L2.)

图2 不同培养时间对菌株L2生物量与抑菌活性的影响
Fig. 2 Effects of culture time on the biomass and antibacterial activity of strain L2

表2 不同硫酸铵饱和度沉淀的蛋白含量及抑菌活性Table 2 The concentrations and antibacterial activities of proteins after ammonium sulfate precipitation

Note:①Ammonium sulfate saturation；②Concentration of protein；③Volume；④ Diameter of inhibition zone

2.5 菌株L2胞外蛋白的胶内抑菌活性检测与活性蛋白的质谱鉴定

菌株L2的胞外产物经饱和度为80%的硫酸铵沉淀后，所得的沉淀可以显著抑制鳗弧菌VIB72的生长，推测其抑菌活性物质可能为大分子蛋白类物质。粗提得到的菌株L2的胞外蛋白经SDS-PAGE分离后进行胶内活性检测发现，培养后的胶块上出现明显的透明圈(见图3)，且经过与染色后的胶条比对，其透明圈位置与胶条上约70 kDa的蛋白条带位置相一致，表明该分子量约为70 kDa的蛋白具有抑菌活性。切下该蛋白条带并经质谱鉴定、Mascot 2.3.01软件进行数据搜索比对，该蛋白与金丽假交替单胞菌JG1分泌的抑菌蛋白PfaP相似性最高，为29.8%(见图4)，推测L2所产生的抑菌蛋白可能与PfaP类似，同属于L-氨基酸氧化酶[12]。

(M. 蛋白质标准分子量(Fermentas, SM0431)；1. 胞外蛋白考马斯亮蓝染色；2. 胞外蛋白胶内活性检测。M. the molecular mass ladder (Fermentas SM0431); 1. the coomassive brilliant blue stained lane; 2. the non-stained lane placed on a MA plate containingV.anguillarum)

图3 胞外蛋白的SDS-PAGE及胶内抑菌活性检测
Fig.3 SDS-PAGE and In-gel antibacterial assay for the ECP of strain L2

(红色为一致的序列。Amino acid sequences sance as pfap are shown in red colour.)

图4 菌株L2的抑菌活性蛋白与JG1分泌的PfaP的氨基酸序列比对
Fig.4 Amino acid sequence comparison between antibacterial protein of strain L2 and PfaP of JG1

3 讨论

目前已发现许多褐杆菌属细菌具有广泛的抑菌活性，可以作为潜在的有益菌应用于水产养殖细菌性病害的防治中。我们分离到的菌株L2可以抑制本实验中的所有病原菌，且抑菌活性强于选用的3种抗生素，表明菌株L2具有作为有益菌进行应用的潜能。经16S rRNA基因序列分析，L2与抑菌褐杆菌(P.inhibens)DSM 16374T亲缘关系最近，同属于褐杆菌属[13]。

褐杆菌属于玫瑰杆菌类群，该类群在海洋浮游微生物群落中占有很大的优势，它们的数量约占某些海域整个浮游细菌群落的15～25%[14-15]，可以营自由生活或附着生活，并且能够有效抑制弧菌的生长[16-17]，是重要的潜在水产有益菌。关于该类群菌株的抑菌活性物质研究较多，它们可以分泌次级代谢物质，如杀菌剂等[18]，能够有效抑制鱼幼体的致病菌[19]并对扇贝的幼虫产生保护效果[20]。目前已知的玫瑰杆菌类群细菌分泌的具有抑菌活性的次级代谢产物主要有tropodithietic acid (TDA)、靛青素 (Indigoidine)等[6, 21]，且绝大多数为吲哚、吲哚衍生物、环状二肽和色胺酮等。抑菌褐杆菌DSM 17395作为玫瑰杆菌类群的模式菌，能够产生具有强抑菌活性的物质TDA[22]，但关于该菌是否可以产生其他抑菌活性物质如抑菌蛋白等至今仍未见报道。我们分离到的菌株L2可以分泌具有抑菌活性的蛋白，且经质谱鉴定，其抑菌蛋白与JG1的抑菌蛋白PfaP的相似性最高，可能为一种L-氨基酸氧化酶。然而，实验结果显示菌株L2与JG1的抑菌谱有所差异，如菌株L2对金黄色葡萄球菌的抑制效果更强于菌株JG1。目前仅有少数报道对L-氨基酸氧化酶进行了成功的异源表达，如Geueke等利用变铅青链霉菌成功获得了有活性的重组L-氨基酸氧化酶[23]，Yang等在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功表达了来自海兔子紫色墨汁中的L-氨基酸氧化酶，获得的重组酶虽具有抑菌活性，但其活性远低于野生型的L-氨基酸氧化酶[24]。

4 结语

我们分离到一株褐杆菌L2，根据其16S rRNA基因序列分析，菌株L2与抑菌褐杆菌(Phaeobacterinhibens)DSM 16374T亲缘关系最近，且对多种病原菌具有广泛的抑菌作用，确定了具有抑菌活性的蛋白条带并进行了质谱鉴定，其抑菌蛋白与金丽假交替单胞菌JG1分泌的抑菌蛋白的相似性较高，推测其为一种L-氨基酸氧化酶。在今后的研究中，我们将进一步分析菌株L2抑菌蛋白的序列，并选取合适的表达载体对该蛋白进行异源重组表达，探讨其在细菌病害防治中的应用价值。