研磨珠均质仪提取增生性瘢痕组织蛋白质的方法

杜雅静 王宇意 章丹婷 郭丽微 方杰 高梦炜 何文涓 钟晓春

摘 要：目的 利用研磨珠均质仪，从临床增生性瘢痕组织样本中充分提取蛋白质。方法 临床收集烧伤后增生性瘢痕组织样本，通过玻璃匀浆器、研磨珠均质仪等方法，提取样本总蛋白，比较提取后残渣，BCA测定总蛋白浓度，蛋白凝胶电泳考马斯亮蓝染色观察蛋白质条带完整性，和western blot比较前列腺素D合成酶的含量（PTGDS）。结果 玻璃匀浆器与研磨珠均质仪联合方法残渣呈絮状均匀，获得蛋白质量最大，差异具有统计学意义（P<0.05），蛋白凝胶电泳考马斯亮蓝染色样本均未降解，Western blot测得联合方法提取样本中前列腺素D合成酶含量更高。结论 玻璃匀浆器与研磨珠均质仪的联合提取临床增生性瘢痕组织样本中获得蛋白质较为高效，是一种临床瘢痕组织蛋白样本提取方法。

关键词：增生性瘢痕；前列腺素；蛋白提取；研磨珠均质仪

中图分类号：R622+.1 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.15.017

文章编号：1006-1959（2018）15-0051-04

Method for Extracting Hyperplastic Scar Tissue Protein by Grinding Bead Homogenizer

DU Ya-jing1，WANG Yu-yi1，ZHANG Dan-ting1，GUO Li-wei1，FANG Jie1，GAO Meng-wei1，HE Wen-juan2， ZHONG Xiao-chun1

（1.Hangzhou Normal University Medical College，Hangzhou 310036，Zhejiang，China；

2.Wuxi Health Vocational and Technical School，Wuxi 214028，Jiangsu，China）

Abstract：Objective To fully extract proteins from clinical hyperplastic scar tissue samples using a bead homogenizer.Methods The samples of hyperplastic scar tissue after burn were collected clinically，and the total protein of the sample was extracted by means of glass homogenizer and grinding bead homogenizer.The residue after extraction was compared.The total protein concentration was determined by BCA.Protein gel electrophoresis was performed by Coomassie blue staining.Band integrity，and prostaglandin D synthetase content（PTGDS）compared to western blot.Results The residue of the glass homogenizer and the grinding bead homogenizer was flocculated uniformly，and the protein content was the largest，which was statistically significant（P<0.05）.The protein gel electrophoresis Coomassie blue stained samples were not degraded，and Western blot was used.The combined method of extracting samples has higher levels of prostaglandin D synthetase.Conclusion The combination of glass homogenizer and grinding bead homogenizer to obtain protein in clinical hyperplastic scar tissue samples is more efficient，and it is a method for extracting clinical scar tissue protein samples.

Key words：Hyperplastic scar；Prostaglandin；Protein extraction；Grinding bead homogenizer

增生性瘢痕（hyperplastic scar，HS）是創伤愈合的异常结局，是皮肤损伤后成纤维细胞增殖，胶原蛋白、纤连蛋白、氨基多聚糖等细胞外基质的过度沉积而致[1]。这种病理性的组织块可有很高的硬度和韧性，在提取其内部蛋白进行临床研究时，如何尽可能地完全破碎、溶解组织且不破坏目的蛋白性质成为了研究中的一个难点。使用玻璃匀浆器研磨瘢痕组织块提取目的蛋白是常用的实验方法，其原理是让玻璃管与柱塞之间微小的缝隙和细微的凹凸咬合，在柱塞转动时，产生碾切作用，使瘢痕组织被轻易的碾碎，但人工研磨效率低，无法研磨不能进入微小缝隙的较大瘢痕组织块，导致研磨不均匀、不完全，无法反映组织块中蛋白的真实含量，影响实验结果的科学性。研磨珠均质仪可以解决研磨不均匀、不完全的问题，其原理是将样品与相应尺寸和硬度的珠子放到研磨管中通过三维高速旋转、振动，靠研磨珠的高速敲打方式对样品进行破碎，可以破碎顽固组织，诸如毛发和皮肤，本文将探讨研磨珠均质仪提取临床瘢痕组织中的蛋白质方法，并以增生性瘢痕组织中的前列腺素D合成酶（PTGDS）为例进行分析。

1材料与方法

1.1试剂及仪器 主要试剂为动物组织全蛋白提取液、BCA蛋白定量试剂盒、PTGDS抗体、Western blot所需试剂。仪器为1 ml玻璃匀浆器、OMNI BEAD RUPTOR 24多样品研磨珠均质仪、1.4 mm陶瓷珠、1 ml研磨管、Bio-Rad电泳仪、Odyssey双红外激光成像系统、BioTek酶联免疫分析仪。 动物组织全蛋白提取液（武汉谷歌生物科技有限公司）、BCA蛋白定量试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）、PTGDS抗体（武汉三鹰）、OMNI BEAD RUPTOR 24多样品研磨珠均质仪（OMNI INTERNATIONAL，INC）、Bio-Rad电泳仪（Bio-Rad Laboratories Inc美国伯乐公司）、Odyssey双红外激光成像系统（Gene Company Limited、基因有限公司）、Bio-Rad 酶联免疫分析仪（Bio-Rad Laboratories Inc，美国伯乐公司）。

1.2样本来源 瘢痕组织均取于患者需手术切除有瘙痒症状的增生性瘢痕，所有取材部位标本经无菌取材后，-80℃冰箱冻存备用。

1.3 实验方法

1.3.1 组织样本提取 将每例组织样本置于冰盒上，用手术刀切细，取约0.05 g组织块，一式三份，按组织样本质量和全蛋白提取液体积比为1 mg：7.5 ml的比例混合后（参照蛋白提取试剂盒），用以下三种方法处理混合物。方法A：在冰浴条件下用玻璃匀浆器研磨混合物10 min；方法B：将混合物置于研磨管，加入3颗研磨珠，用研磨珠均质仪以8 m/s破碎40 s；方法C：在冰浴条件下用玻璃匀浆器研磨混合物10 min后，转移组织匀浆至研磨管，加入3颗研磨珠，用研磨珠均质仪，以8 m/s研磨40 s。将上述方法制备的最终组织匀浆，以12000 r/min离心5 min，取上清-80 ℃冰箱保存备用。离心沉淀物，用注射针头挑出，置于黑色背景塑料纸上，尽量摊开样本，然后摄像留存。

1.3.2 上清液中总蛋白浓度测定 取BCA试剂盒适量25 mg/ml蛋白标准溶液，稀释至终浓度为0.5 mg/ml。按标准品的浓度梯度做标准曲线，将待测的蛋白样品稀释至合适浓度，加到96孔板中，按BCA试剂和硫酸铜溶液体积比为50：1的比例配制适量BCA工作液，充分混匀。每孔加入BCA工作液，充分混匀，37 ℃放置30 min后，以标准曲线做参比，在562 nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。以标准品蛋白含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值，根据标准曲线得到相应的蛋白含量，计算样品实际浓度。

1.3.3 蛋白质考马斯亮兰染色 蛋白上清液按体积比与上样缓冲液（Loading Buffer）体积比为4：1混匀，沸水浴煮5 min后9000 r/min快速离心待用。制备12%SDS-聚丙烯酰胺胶，按总蛋白量相等加样。以恒壓60 V进行浓缩胶的电泳，以恒压120 V进行分离胶的电泳，至溴酚蓝跑至底部终止。用考马斯亮蓝染色液染胶块2 h，甲醇洗脱4 h，扫描仪摄图。

1.3.4Western bolt检测上清液中PTGDS的表达 按12%SDS-聚丙烯酰胺胶制胶，按总蛋白量相等加样。电泳时恒压60 V浓缩胶，恒压120 V分离胶，电泳至溴酚蓝跑至底部终止。把膜浸在20 ml的牛奶液中并放置摇床上1 h，封闭完后用TBST洗3次，每次5 min。然后放入β-actin抗体及前列腺素D合成酶（PTGDS）抗体中，放入4℃冰箱摇床中过夜。第2天取出膜孵二抗（辣根过氧化酶 HRP），室温下置于摇床孵育90 min，用TBST洗3次，使用Odyssey荧光扫描仪，进行成像保存，并用Odyssey工具软件分析I.I.K counts值，计算PTGDS/β-actin的I.I.K counts值之比。

2结果

2.1 三种方法提取样品后残渣比较 三种方法粉碎增生性瘢痕组织样本，12000 r/min离心5 min去上清，取出沉淀物观察后，方法A、B所得残渣呈块状丝状粘连，大小不一不规则的固体残余，大块固体可达5 mm×5 mm。方法C残渣呈均匀絮状，见图1。

2.2 BCA测定蛋白含量 三种方法粉碎增生性瘢痕组织样本离心后的上清液，经试剂盒BCA测定蛋白浓度，方法A、B、C之间差异有统计学意义（P<0.05），方法C的总蛋白浓度均数大于方法A、B（图2）。

2.3蛋白电泳考马斯亮蓝染色 蛋白样本经凝胶电泳后染色，蛋白质电泳条带清晰，在45 KDa和25 KDa附近未见降解现象，β-actin分子量大小为43 KDa，PTGDS分子量大小为28 KDa，是本文实验中将要检测的分子（图3）。

2.4 Western blot结果 从图（图4）直接观察，β-actin的表达在方法A、B、C中，最高的是A方法，PTGDS荧光亮度高也是如此，经用Odyssey工具软件分析β-actin与PTGDS灰度值，以β-actin校正，发现方法C的PTGDS灰度值之比大于方法A、B。

3讨论

增生性瘢痕是创伤愈合过程的不完善的替代，是创伤愈合后常见并发症，不仅影响患者的外观，而且由于挛缩畸形导致的功能障碍，加之常常伴有的灼痛、瘙痒等症状，还为该类患者带来沉重的经济与心理负担[2]。因此，增生性瘢痕不仅是外科修复的难点，更是许多科研工作者的研究热点。

在研究瘢痕组织时，我们常常需要进行分子水平上的探索，如何尽可能最大程度的获取所研究的目的蛋白是研究顺利进行的保障[3]。提取瘢痕组织蛋白常用到的方法有玻璃匀浆器提取法及液氮分解法，在使用以上方法提取瘢痕总蛋白时，我们发现图1瘢痕组织残渣较大、不均匀，难以确保所测目的蛋白含量的准确性。且在玻璃匀浆器研磨的过程中，多次出现组织块嵌塞在玻璃管和柱塞之间导致碾切时玻璃管爆裂的情况，故我们认为单用玻璃匀浆器较难适用于某些坚韧瘢痕组织的蛋白。因此，在玻璃匀浆器的基础上，我们加入了研磨前的人工切碎步骤，并使用了更快速有效的研磨珠均质仪。在单用研磨珠均质仪时，我们发现瘢痕组织残渣比单用玻璃匀浆器要小，但不均匀，所以又提出联合两种方法，进行了三种方法的比较实验。从图1物理粉碎效果看，方法A、B所得残渣呈块状丝状粘连，方法C均匀絮状，提示方法C物理破碎更均匀更细腻。从BCA结果上看，方法A、B的总蛋白浓度低，方法C高，统计学显示方法A、B与C之间，差异有统计学意义（P<0.05），图2与物理粉碎效果一致，提示三种方法中，方法C提取总蛋白浓度最好。从图3考马斯亮蓝染色结果上看，三种方法没有明显差异，45 KDa与25 KDa条带均未见蛋白质降解现象。从图4Western blot结果上看，β-actin校正后，方法C的PTGDS灰度值之比大，提取PTGDS的效果更好。由于实验经费的限制，仅作初步分析未进行统计学分析。

PTGDS亦为瘢痕组织中所含蛋白质之一，主要催化PGH2生成PGD2[4]， PGD2 作为一种神经调节分子， 可调节睡眠、体温、嗅觉功能、激素释放以及中枢神经系统中的疼痛反射， 还可以抑制血小板凝集、诱导血管舒张等，由肥大细胞释放的 PGD2 也可以作为过敏反应和炎症反应的调节分子[5]，调节增生性瘢痕的形成，是临床上研究增生性瘢痕的瘙痒因子之一。本次实验方法C相较其他两种而言，提取PTGDS效果好。凡是涉及到了瘢痕组织块中某物质的含量的研究，都需要面临瘢痕组织是否研磨均匀、充分的问题，而这一难点由瘢痕组织的坚韧性所决定的。病理性瘢痕组织是人体中较为坚韧的组织，目前未见有关这方面的研究文献，本文可为病理性瘢痕组织的破碎、更充分地提取蛋白质提供了一种有效的方法。

综上所述，临床增生性瘢痕组织提取采用玻璃匀浆器，研磨珠均质仪联合使用的方法提取蛋白浓度最高，较大程度地解决了玻璃匀浆器无法研磨完全及效率低的问题，比单用传统的玻璃匀浆器更好，是三种方法中的優者。但在操作过程中，我们发现其所耗费的时间较长，步骤较复杂。方法C中使用3颗珠子，最大速度8 m/s，40 s的参数，或许还可以通过增加时间、增加珠子的颗数材质直径等来提高效率。因此下一步我们将研究这些方面，来探索用研磨珠提取瘢痕组织最佳参数。

致谢：在本文研究过程中，本校陈功星和马子坤给予了指导和参与其它相关工作，在此表示感谢！

参考文献：

[1]李子虎，吕大伦.增生性瘢痕的发生机制及治疗进展[J].新乡医学院学报，2015，32（4）：370-373

[2]胥广，黄东.增生性瘢痕形成机制及治疗的现况与展望[J].现代医院，2015，15（2）：10-14

[3]沈晓洁，袁志坚，周梅芳，等.PGDS和PGES在增生性瘢痕中的表达[J].江苏医药，2015（18）：2135-2137

[4]吴双双，吴建辉，孙祖越.前列腺素合成酶基因调控与前列腺疾病关系的研究进展[J].中华男科学杂志，2017，23（07）：663-667.

[5]胡士军，朱辉，杨增明.前列腺素D2及其受体与哺乳动物生殖[J].动物学杂志，2004（03）：91-96.

收稿日期：2018-4-20；修回日期：2018-5-22

编辑/李桦