基于石墨烯复合材料的电化学传感器在基因检测中的研究进展

彭 钢，俞亚东，陈晓君，黄 和

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏南京211800；2.江苏先进生物与化学制造协同创新中心，江苏南京210009；3.南京工业大学 化学与分子工程学院，江苏南京211800；4.南京工业大学 药学院，江苏南京211800)

随着中国经济的增长和人民生活水平的不断提高，健康问题和食品安全成为人们关注的焦点，人类的各种疾病基本都是遗传因素与环境因素共同导致的[1]；同时，转基因食品的安全性和食品掺假是食品安全中被普遍关注的问题[2]。鉴于此，发展基因检测技术对基因疾病诊断、疾病预防性基因体检和食品安全检测尤为重要。目前基因检测常用方法有荧光定量聚合酶链式反应[3]、基因芯片[4]、液态生物芯片[5]、微流控技术[6]、Northern和Western印迹[7]等技术。尽管这些方法具有灵敏度高、准确性强等优点，但对仪器的要求较高，而且需要对样品进行繁琐的前处理，成本高、耗时长，不适于大量样品的现场快速检测。与其他方法相比，电化学传感器具有制备简单、成本低、耗时短等优点，成为基因检测的研究热点。但是，开发性能优异的电化学传感器需要做到以下两点：①传感器界面的构建；②电信号的放大。然而传感器界面的构建和电信号的放大离不开优异性能的材料。

纳米材料具有独特的优势，如体积效应、表面效应、量子尺寸效应、介电限域效应和量子隧道效应，使其在电化学传感器领域得到广泛应用。近年来的研究发现，纳米尺度下的新型二维材料，如石墨烯及其复合材料等，具有优异的物理化学性能，为探索开发快速、灵敏、低成本、稳定的基因检测新方法带来了希望[8-11]。本文中，笔者就近年来基于石墨烯复合材料的电化学传感器在基因检测领域的研究进行综述。

1 石墨烯特性

石墨烯是由纯碳原子六元环平面结构构成的、只有一层原子厚度的二维晶体[12]。它可以翘曲成零维的富勒烯，卷成一维的碳纳米管或者堆垛成三维的石墨[13](图1)。2004年，英国曼彻斯特大学物理学家安德烈·盖姆和康斯坦丁·诺沃肖洛夫，首次利用机械剥离的方法成功从石墨中分离出石墨烯，证实它可以单独存在，推动了科学家们对二维纳米材料的研究热情[14]。石墨烯具有非常大的理论比表面积、很高的力学强度[15]、超高的光学透过率、优良的导热性[16]、高导电性和荧光猝灭特性等。石墨烯更为奇特之处是它具有独特的电子结构和电学性质，能隙为0，而且石墨烯中电子的运动速度达到光速的1/300[17]。石墨烯具有的奇特性质，使得其能够满足高灵敏性传感器设计的需求，为发展基因检测技术带来希望。

图1 石墨烯翘曲成零维富勒烯，卷成一维碳纳米管 或者堆垛成三维的石墨[13]Fig.1 Graphene can be wrapped up into 0D fullerenes, rolled into 1D nanotubes or stacked into 3D graphite[13]

2 石墨烯的制备方法

由于单层或多层石墨烯材料广泛应用于各个领域，而且自然界中石墨烯以堆叠成石墨形式存在，促成制备高质量、大面积、尺寸可控、层数可控的石墨烯方法不断发展。目前，石墨烯的制备方法可分为物理方法和化学方法。物理方法包括机械剥离法[18-19]、液相直接剥离法[20-22]等；化学方法包括氧化石墨还原法[23-27]、化学气相沉积法(CVD)[28-32]等，表1总结了几种常用的石墨烯制备方法。

表1 石墨烯制备的常用方法

然而，上述方法制备石墨烯，存在着不能同时满足制备出尺寸大、质量好、精确控制纳米片的层数、容易转移到其他基体、成本低等需求的问题(表2)。因而，石墨烯的制备仍将是今后研究的重点。

表2 几种常见的石墨烯制备方法优缺点比较

3 石墨烯复合材料电化学传感器在基因检测中的应用

石墨烯独特的结构、优异的性能引起了研究者极大的兴趣，但单一的石墨烯材料往往因为团聚，难以发挥其优异的性能，最近研究发现石墨烯复合材料可以有效地抑制石墨烯的不可逆团聚，充分发挥石墨烯以及石墨烯复合材料的优异性能[33]。基于石墨烯的复合材料是石墨烯应用领域中的重要研究方向之一，在能量储存[34]、液晶器件[35]、生物成像[36]和传感器件[37]等领域展现出了优良性能，具有广阔的应用前景。根据组分不同，石墨烯复合材料可分为石墨烯/无机复合材料、石墨烯/有机复合材料、石墨烯/有机/无机复合材料和其他石墨烯复合材料，将进行详细讨论。

3.1 石墨烯/无机复合材料

石墨烯/无机物纳米复合材料是通过一步法或多步法合成的。Chen等[38]通过一步水热法合成了氮掺杂石墨烯/Fe3O4粒子复合材料，并构建了电化学传感器应用于DNA的检测。Hajihosseini等[39]通过两步法将石墨烯/纳米金复合材料修饰在电极表面构成一个传感器，并应用于DNA的检测。在复合材料中，无机纳米粒子可以增加石墨烯的片层间距，阻碍石墨烯的不可逆团聚，保留单层石墨烯的结构和性质；而且，无机纳米粒子和石墨烯之间的协同效应使得复合材料拥有了更加优异的性能。

Chen等[40]利用氧化石墨烯、氨水和水合肼一步水热合成了氮掺杂石墨烯，乙二醇作为还原剂制备了氮掺杂石墨烯/纳米金复合物，构建了一种基于氮掺杂石墨烯/纳米金复合物的电化学生物传感器(图2)，在最优条件下，采用差分脉冲伏安法检测人类多药耐药基因的线性范围为1.0×10-14～1.0×10-7mol/L，检出限为3.12×10-15mol/L。Wang等[41]采用电化学沉积法制备了石墨烯/纳米金修饰玻碳电极，在最优条件下，对目标DNA的检测范围为1.0×10-16～1.0×10-7mol/L，检测限为3.5×10-17mol/L。Jafari等[42]制备了氧化铈纳米粒子/石墨烯复合物，将其修饰到玻碳电极表面，构建DNA传感器，对DNA的线性响应范围为1.0×10-15～1.0×10-8mol/L，检出限为1.0×10-16mol/L。Teymourian等[10]制备了Fe3O4纳米粒子/石墨烯复合材料应用于DNA检测，线性响应范围为1.0×10-17～1.0×10-10mol/L。Shuai等[43]制备出MgO纳米粒子/纳米金/石墨烯复合材料，构建了RNA电化学传感器，获得的线性响应范围为1.0×10-16～1.0×10-13mol/L，检出限为5.0×10-17mol/L。可见，石墨烯/无机复合材料被应用到基因检测领域并得到快速发展。笔者总结了近几年石墨烯/无机复合材料在基因检测方面的研究应用，汇总于表3。

图2 电化学DNA传感器构建流程[40]Fig.2 Schematic representation of the electrochemical DNA biosensor[40]

复合材料检测对象线性范围/(mol·L-1)检出限/(mol·L-1)文献石墨烯/氧化镍DNA1.0×10-13～1.0×10-63.12×10-14[44]石墨烯/氧化锆DNA1.0×10-13～1.0×10-63.23×10-14[45]石墨烯/纳米银DNA1.0×10-14～1.0×10-87.6×10-15[46]石墨烯/纳米金DNA5.0×10-16～5.0×10-113.6×10-16[47]石墨烯/氧化钇DNA1.0×10-17～1.0×10-95.95×10-18[48]石墨烯/纳米金/氧化镁RNA1.0×10-16～1.0×10-135.0×10-17[43]石墨烯/二硫化钨DNA1.0×10-14～5.0×10-102.3×10-15[49]

3.2 石墨烯/有机复合材料

石墨烯中的π-π共轭结构能够通过π-π堆积作用被有机物功能化，同时，石墨烯被羧基化或羟基化后也能够通过共价键连接有机物，形成石墨烯/有机复合材料。Zainudin等[11]利用π-π堆积作用制备了1-吡啶酸/石墨烯复合材料，构建了阻抗型电化学传感器应用于检测大肠杆菌DNA，线性检测范围为1.0×10-14～1.0×10-10mol/L，检出限为7.0×10-16mol/L。Zhang等[50]依据π-π堆积作用合成了色胺/石墨烯复合材料，然后修饰到玻碳电极表面，构成无标记的DNA电化学传感器(图3)，通过阻抗分析获得线性检测范围为1.0×10-12～1.0×10-7mol/L，检出限为5.2×10-13mol/L。Li等[51]利用全氟磺酸/石墨烯修饰丝网印刷碳电极，以胭脂红酸为信号探针，构建了DNA电化学传感器用于目标HIV-1序列的检测。在最优条件下，获得的线性检测范围为4.0×10-8～2.56×10-6mol/L，检出限为5.0×10-9mol/L。Tran等[52]制备了碳纳米管/石墨烯复合物，将其修饰到丝网印刷金电极表

面，并利用辣根过氧化物酶催化系统进行信号放大，构建了RNA传感器，线性范围1.0×10-14～1.0×10-10mol/L。由于有机物种类多，因此，石墨烯/有机复合材料电化学传感器在基因检测中的应用潜力巨大。笔者总结了近几年石墨烯/有机复合材料在基因检测方面的研究应用，汇总于表4。

图3 电化学DNA传感器构建流程[50]Fig.3 Schematic representation of the electrochemical DNA biosensor[50]

表4 基于石墨烯/有机复合材料电化学传感器在基因检测中的应用实例

3.3 石墨烯/有机/无机复合材料

为了充分发挥各种材料的性能以及完善石墨烯纳米复合材料的不足，研究人员进一步合成了石墨烯/有机/无机复合材料。有机物富含芳香基团和各种官能团，易于与石墨烯结合，同时还可以用作石墨烯与无机物结合的桥梁，例如，Yola等[56]首先利用巯基乙胺使石墨烯富含巯基，再通过金-巯键结合金铁纳米复合物合成了石墨烯/有机物/无机物复合材料，并用碱性蓝41作为信号分子，构建了高灵敏的DNA电化学传感器应用于DNA检测，获得了较好的线性范围1.0×10-14～1.0×10-8mol/L，检出限为2.0×10-15mol/L。Shi等[9]首先通过滴涂将石墨烯固定在电极表面，然后通过π-π堆积作用将带负电的聚苯乙烯磺酸固定在电极表面，最后通过静电作用将带正电的金纳米棒固定在电极表面，以阿霉素为信号分子，构建DNA电化学传感器用于目标DNA检测(图4)，通过差分脉冲伏安法分析获得线性检测范围为1.0×10-16～1.0×10-9mol/L，检出限为3.5×10-17mol/L。Huang等[57]首先将石墨烯与纳米金修饰在玻碳电极表面，然后通过循环伏安法将硫堇沉积在电极表面形成石墨烯/纳米金/硫堇复合物，以1,10-邻菲咯啉二氯合钌为信号分子，构建DNA电化学传感器用于人乳头瘤病毒DNA检测，获得线性检测范围为1.0×10-13～1.0×10-10mol/L，检出限为4.03×10-14mol/L。Liu等[58]合成了聚酰胺-胺型树状大分子/银金纳米簇复合物，通过酰胺键与修饰在电极表面的石墨烯结合，形成石墨烯/聚酰胺-胺型树状大分子/银金纳米簇复合物，并利用辣根过氧化物酶催化作用对信号进行放大，构建RNA电化学传感器应用于microRNA-126检测，线性响应范围为1.0×10-15～1.0×10-8mol/L，检出限为7.9×10-16mol/L。不难看出，石墨烯/有机/无机复合物材料充分发挥了各自的特性，具有协同效应，这将为发展更优异的电化学基因检测传感器带来希望。笔者总结了近几年石墨烯/有机/无机复合材料在基因检测方面的研究应用，汇总于表5。

图4 电化学DNA传感器构建流程[9]Fig.4 Schematic representation of the electrochemical DNA biosensor[9]

复合材料检测对象线性范围/(mol·L-1)检出限/(mol·L-1)文献石墨烯/巯基乙胺/纳米金铁DNA1.0×10-14～1.0×10-82.0×10-15[56]石墨烯/壳聚糖/二硫化钒DNA5.0×10-13～5.0×10-105.2×10-14[59]石墨烯/聚苯乙烯磺酸/金纳米棒DNA1.0×10-16～1.0×10-93.5×10-17[9]石墨烯/纳米金/聚硫堇DNA1.0×10-13～1.0×10-104.03×10-14[57]石墨烯/氧化铁/聚黄尿酸DNA1.0×10-16～1.0×10-93.2×10-17[60]石墨烯/聚苯胺/纳米金DNA1.0×10-11～2.0×10-81.05×10-12[61]石墨烯/聚酰胺胺/银金纳米RNA1.0×10-15～1.0×10-87.9×10-16[58]石墨烯/铁酸镍/壳聚糖DNA1.0×10-16～1.0×10-61.0×10-16[62]石墨烯/碳纳米管/纳米金DNA1.0×10-16～5.0×10-103.3×10-17[63]石墨烯/壳聚糖/聚苯胺/纳米金DNA1.0×10-11～5.0×10-92.11×10-12[64]石墨烯/氧化锌/1芘丁酸琥珀酰亚胺酯RNA1.0×10-11～1.0×10-64.3×10-12[65]

3.4 其他石墨烯复合材料

石墨烯还可以与其他材料如血红素、酶和DNA形成复合材料，赋予复合材料更好的生物相容性。Ye等[66]利用血红素将石墨烯功能化固定在电极表面，然后通过电沉积将纳米金固定在电极表面，构成DNA电化学传感器用于DNA检测，获得的线性检测范围为1.0×10-18～1.0×10-13mol/L，检出限为1.4×10-19mol/L。Hu等[67]利用石墨烯量子点作为载体固定辣根过氧化物酶进行信号放大，构建RNA电化学传感器，检测miRNA-155时获得的线性范围为1.0×10-15～1.0×10-10mol/L，检出限为1.4×10-16mol/L。更多的石墨烯复合材料有待研究者进一步研究和开发，使其在电化学基因检测中的应用越来越多。

4 总结与展望

综上所述，石墨烯复合材料在电化学基因传感的应用中展现出了优越的性能，主要归因于：1)石墨烯具有大的比表面积、高的导电性和良好的生物相容性；2)石墨烯复合材料中各组分之间相互的协同效应。同时，笔者也发现研究中存在的一些不足：1)石墨烯尺寸的不均匀性影响了传感器的灵敏度、稳定性和重现性；2)石墨烯复合材料的结构缺陷明显地影响了其电子传递性能，而且复合材料中各组分比例不同也会影响复合材料的综合性能。

为了使石墨烯复合材料在基因检测分析中有更好的应用前景，笔者提出两点建议：1)研发更加温和地制备均匀石墨烯的方法；2)制备石墨烯复合材料时，深入研究各组分比例对复合材料性质及传感性能的影响。相信随着科学家们不断的研究和新技术的成熟，基于石墨烯复合材料电化学传感器在实际基因检测中将有广阔的应用前景。