生前溺死与死后入水SD大鼠心脏与脾内硅藻检验的研究

刘泉 ，陈轶群 ，柯技 ，王树法

1.湖北警官学院侦查系，湖北武汉 430034；2.湖北三真司法鉴定中心，湖北武汉 430034；3.湖北崇新司法鉴定中心，湖北武汉 430403；4.湖北警官学院实验中心，湖北武汉 430034

判断水中的尸体是否为生前溺死还是死后抛尸是法医学非常重要的工作内容之一。一般情况下，如果尸体较为新鲜，可以根据溺死的特征性尸体征象，如口鼻部的蕈样泡沫、上呼吸道内有溺液和异物、水性肺水肿等来进行判断。但在实际检案中，水中尸体被发现时常常已高度腐败，尸体征象变得不明显，这时仅依据尸体征象进行溺死的判断，准确性大大降低。在这种情况下，法医学工作者会选取一些实验室的方法辅助诊断溺死。在我国，硅藻检验被认为是溺死诊断的重要辅助手段[1]。一般在肺、肝、肾等器官同时发现硅藻，且硅藻种类与实地水样一致，即可诊断为溺死[2]。

尽管硅藻检验被很多人认为是溺死诊断的“金标准”，但也有人通过实验发现，非溺死者的内脏中也有硅藻，从而对硅藻诊断溺死提出异议[3]。但大量实验表明，非溺死者与溺死者肺内硅藻数量存在显著差异[2，4]，从而提示可以通过硅藻的量化分析对生前溺死进行判断，从而降低误判的风险。现有的与硅藻量化有关的研究主要集中在肺组织，但除了肺组织以外，其它内脏器官内的硅藻是否也有类似的差异，却未见报道。

该课题组选用2016年9月购置于华中科技大学同济医学院实验动物中心的100只SD大鼠为研究对象，利用微波消解-真空抽滤-光镜观察法对生前溺死与死后入水的SD大鼠的心脏与脾内硅藻进行定性定量分析研究，以探讨体循环内脏器官硅藻量化在法医学溺死诊断中的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验仪器 Topex微波消解系统、高分子聚合材料消解罐、G-100电子恒温加热器、，HL-6多联真空抽滤设备，烤片机，聚醚砜滤膜抽滤杯，数字虚拟切片工作站。

1.1.2 实验试剂 分析纯硝酸、30%双氧水溶液、乙酸，丁香油酚，双蒸水（自制）。

1.1.3 硅藻源与实验动物 小环藻属硅藻（中科院水生生物研究所）；100只雄性实验室标准SD大鼠，体重250～350 g（华中科技大学同济医学院实验动物中心）。

1.2 方法

1.2.1 实验模型的制备 水样模型的制备：用电子天平分别精确称取硅藻土，各放入双蒸水中，将硅藻水的浓度调至0.01,0.02,0.04 g/L和0.08 g/L。动物模型的制备：100只SD大鼠，每10只大鼠为一组，被随机分成10组：4个生前溺死组、4个死后抛尸组、1个空白生前溺死组、1个空白死后抛尸组。生前溺死组：将SD大鼠称重记录，然后放入金属捕鼠笼里，静置2 min，然后连同笼子一起，分别浸入前面制备的水样中1 min，然后提出水面，静置30 s后再沉入水面。按此循环5次，使SD大鼠充分溺死，死后的SD大鼠在水样中持续浸至30 min后取出。

死后抛尸组：将SD大鼠称重记录，使用动脉空气栓塞法处死。然后采取与生前溺死组相同的方法处理大鼠。

空白生前溺死组与空白死后抛尸组使用无硅藻的双蒸水作为水样进行实验，实验步骤同生前溺死组。

1.2.2 检材提取与硅藻检验 用双蒸水反复冲洗大鼠体表，然后切开皮肤，更换干净无硅藻污染的工具，切开肌肉和内脏包膜，再次更换干净无硅藻污染的工具，取出心脏，放置干净的器皿中，称重并记录。采用同样的方法取出脾脏，称重并记录。采用微波消解-真空抽滤方法对取出的整个脏器和水样进行消化、制切。整个解剖过程严格操作步骤，防止污染。

1.2.3 统计方法 利用数字虚拟切片工作站记录各个切片中的硅藻数量，只有完整的硅藻才会被记录下来。将每个组织样本中观察到的硅藻总数量除以相应组织的质量，得到每个组织中的硅藻数量质量比。采用Microsoft Excel及SPSS 22.0统计学软件对收集的数据进行处理。计数资料使用χ2检验，计量资料使用t检验和Spearman回归分析对数据进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠器官重量及水样中硅藻数量结果

100只SD大鼠心脏重量在0.93～1.62 g之间，所有SD大鼠脾脏重量在0.57～1.1 g之间。水样模型中硅藻数量分别是(1 766.67±1 027.73)个(0.01 g/L)，(3 166.67±1 118.49)个(0.02 g/L)，(5 633.33±1 994.49)个(0.04 g/L)和(9 500.00±2 291.00)个(0.08 g/L)。

2.2 硅藻数量质量比结果

在死后抛尸组、空白生前溺死组和空白死后抛尸组的大鼠心脏和脾脏中均未观察到硅藻，其心脏和脾脏的硅藻的数量质量比均为0个/g。生前溺死组与死后抛尸组各浓度硅藻数量质量比差异有统计学意义（P＜0.01）；生前溺死组中，各组织的硅藻数量质量比见表1。表1中显示，心脏和脾脏的硅藻的数量质量比基本会随着水样的浓度升高而增加，通过Spearman回归分析差异有统计学意义（P＜0.01）；在 0.01，0.02，0.04 g/L浓度水样下的心脏和脾脏内的硅藻数量质量比差异无统计学意义（P＞0.05）；在0.08 g/L浓度水样下的心脏和脾脏内的硅藻数量质量比差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 生前溺死组心脏与脾脏在不同浓度水样中硅藻的数量质量比[（±s），个/g]

表1 生前溺死组心脏与脾脏在不同浓度水样中硅藻的数量质量比[（±s），个/g]

注：各浓度的数量质量比值是用均数的形式表示。他们与水样浓度之间的关系通过Spearman回归分析P＜0.01，说明数量质量比值随着水样浓度变化而变化。

脏器心脏脾脏t值P值数量质量比值0.01 g/L 0.02 g/L 0.04 g/L 0.08 g/L 0.49±0.34 0.86±0.75 1.43 0.19 1.08±0.75 0.80±0.81-2.08 0.07 1.22±0.79 1.52±1.21 0.99 0.35 1.52±1.08 2.80±1.69 2.77 0.02

2.3 硅藻检出率结果

生前溺死组所有脏器的硅藻检出率大于50%。生前溺死组心脏和脾脏的硅藻检出率均随着水样硅藻浓度的增加而检出率增大，且两脏器的硅藻检出率之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 生前溺死组心脏与脾脏在不同浓度水样中硅藻检出率（%）

3 讨论

硅藻是一种单细胞藻类，其主要特点是其有富含硅质的细胞壁，可以抵御强酸强碱[5]。硅藻种类超过万种，广泛存在于自然界中，几乎在每种水域中都能发现硅藻的踪影。由于硅藻的这些特点，使得硅藻检验成为溺死诊断的金标准[6-8]。但硅藻检验的实验过程易被污染，且身前呛水也可能会吸入少量硅藻[9]，因此也有人对硅藻检验判断溺死提出了异议。但更多学者认为只要严格规范检验步骤，是可以有效控制污染的。该实验设置了空白生前溺死组与空白死后抛尸组，两组结果硅藻均为0。这表明该实验系统没有交叉污染，硅藻检验结果可靠。

在溺水过程中，硅藻会随着呼吸运动到达肺组织，然后部分硅藻穿过气血屏障，进入到血液循环，分布到全身各个器官。因此，肺是溺死过程中，硅藻首先到达的器官，所以目前，有关硅藻检验的定量研究主要集中在肺组织。如李向阳等人[2]对62只新西兰大白兔的各肺叶中的硅藻进行分析发现生前溺死组与死后抛尸组各肺叶中均能检出小环藻硅藻，检出率均为100%，但生前溺死组中小环藻数量明显多于死后抛尸组。朱德全等人[4]以32只五指山猪为研究对象，对肺组织及左、右心室血内的硅藻进行定性和定量分析，也发现死后抛尸组的肺内能观察到硅藻，且硅藻含量显著小于溺死组肺内硅藻含量(P＜0.05)；溺死组左右心室血中硅藻数量分别为 （33±54.72）个/mL和（9±13.33）个/mL，而死后入水组心室血内均未检出硅藻。该实验，在已知死因的前提下，研究了溺死组与死后抛尸组SD大鼠心、脾的硅藻数量质量比，发现生前溺死组与死后抛尸组检出硅藻数量质量比差异有统计学意义（P＜0.01），这与之前的有关肺组织硅藻检验结果是类似的，即生前溺死组体内硅藻数明显多于死后抛尸组，这表明心、脾作为内脏器官可与肺组织一样，用于硅藻检验。该实验结果显示死后抛尸组心、脾检出硅藻数为0，与朱德全等人研究的山猪的心室血中的检验结果一致，这与以往有关死后抛尸组肺组织也能检出硅藻不同，这表明心、脾用于硅藻检验的特异性比肺组织更强。

不仅如此，该课题组还比较了同一硅藻水样浓度下的大鼠心脏与脾脏，发现无论在哪个浓度，两脏器硅藻检出率均差异无统计学意义（P＞0.05）；心脏和脾脏内的硅藻数量质量比在低于0.04 g/L的同一浓度水样下的SD大鼠的是差异无统计学意义（P＞0.05），只有0.08 g/L的浓度水样下，两脏器的硅藻数量质量比才差异有统计学意义（P=0.02），这个结果暗示，低浓度下心脏和脾脏在硅藻检验的效力上是差不多的，而只有当水样中硅藻浓度升高到一定程度，这两个脏器之间才在硅藻数量质量比上产生差异。而类似的不同硅藻水样浓度下的研究，尚未见报道。

在硅藻检验中，除了检验内脏中的硅藻，还要检验发现尸体所在水域中的硅藻。如果水域中的硅藻种类和器官中硅藻一样，这将是一个强有力的证据证明死者生前溺水[10-12]。但有时，发现尸体的时候可能已经过了很长时间，或是尸体已经漂流了很长一段距离。这时尸体周围水域中硅藻的种类和数量已经与溺死发生时周围水域中的有很大不同。该实验结果显示进入SD大鼠的心脏和脾脏的硅藻数量会随水样的浓度升高而增加（Spearman回归分析 P＜0.01），这个结果暗示可能根据器官内硅藻数量来计算水中硅藻的浓度范围，这提供了一种在溺水时确定溺死地点硅藻数量的可能途径。如果硅藻检验能考虑到环境等因素，这会使得硅藻检验诊断溺死更加可信。

在实际检案中，内脏的取材量对硅藻的检出率也是有影响的，因此在常用的破机罐法的硅藻检验中，对内脏的提取量有一个推荐范围[13]。该实验选用的是SD大鼠，体型较小，取材内脏重量在1 g上下，无法严格比照推荐取材量进行检材。因此，将内脏的取材量考虑在内，将SD大鼠内脏中硅藻的数量与质量作为一个比值再进行分析，能更客观的反映硅藻在心脏、脾脏这两个脏器中的变化情况。

硅藻检验中，除了取材量，还有很多其它因素也会影响最终硅藻的检出数量，如水中硅藻数量、消化程度、离心次数、玻片制备等[14]。这些实验步骤均可能造成硅藻的丢失，从而降低检出率。该实验选用的是微波消解联合真空抽滤的方法进行硅藻检验，该方法消化组织完全、无离心损耗，极大的提高了硅藻的检出率[15]。但在实验结果中，溺死组心脏或脾脏的硅藻检出率均小于100%，说明溺死组中两脏器仍存在硅藻数为0的假阴性结果。这可能一方面表明心脏和脾脏对于硅藻检验而言，并不是很敏感的器官。另一方面，SD大鼠组织器官较小，可能也是造成假阴性结果的原因之一。如果使用更大型动物做该实验，可以取得的内脏组织器官质量就更大，假阴性结果可能就会减少或消除。除此以外，该实验结果显示心脏或脾脏的硅藻检出率基本随着水样浓度的增加而增加，这说明只要水样中硅藻数量足够，其假阴性结果也可能会减少或消除。

综上所述，空白生前溺死组与空白死后抛尸组结果均为0，说明该实验系统没有交叉污染，硅藻检验结果可靠，也同时说明硅藻检验过程中污染是可控的；溺死组与死后抛尸组心脏和脾脏硅藻数量质量比有显著性差异，死后抛尸组所有脏器硅藻检出数为0，溺死组所有脏器硅藻的检出率低于100%，说明心脏和脾脏可用于硅藻检验，且具有高特异性和低灵敏度的特点；心脏与脾脏的硅藻的数量质量比基本随着水中硅藻浓度的增加而增加，说明脏器内硅藻数量与水中硅藻数量有相关性。但目前的研究仅限于单种硅藻 （小环藻），其它类型的硅藻是否也具有类似的特点，还需要进一步的研究。