重楼皂苷Ⅶ抑制内皮素1诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移

赵方允，王紫微，张春芳，张 悦，徐双兰，邢西迁，杨 姣

(昆明医科大学附属延安医院 1. 药学部、2. 呼吸内一科，云南 昆明 650051；3. 昆明医科大学第一附属医院呼吸内一科，云南 昆明 650032)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是由于肺血管收缩反应性增强及肺血管结构重建，最终引起肺动脉压力升高为特征的一组病理生理综合征[1-2]。其中，由肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)增殖、迁移所引起的肺血管结构重建，是PAH形成的中心环节[3-5]。重楼为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎，主要成分重楼皂苷具有抗肿瘤、止血、抗炎、镇痛、镇静、抑制血管生成、免疫调节、抗氧化等功效[6-7]。其中，抗炎及抑制血管生成的作用可能会对PAH的防治起一定作用。该文主要研究重楼皂苷Ⅶ(polyphyllin Ⅶ, PPⅦ)对内皮素-1(endothilin-1，ET-1)诱导的大鼠PASMCs增殖和迁移的作用。

1 材料

1.1试剂重楼皂苷Ⅶ，纯度≥98%(索莱宝公司)；ET-1(Sigma公司)；DMEM高糖培养液、胎牛血清(BI公司)；CCK-8细胞增殖检测试剂盒(日本同仁)；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)；细胞周期检测试剂盒( Beckman公司)。

1.2实验动物SPF级，♂，Sprague-Dawley(SD)大鼠，6～8周龄，购自昆明医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(滇)k2015-0002。

2 方法

2.1PASMCs的原代分离、培养与鉴定采用Ⅱ型胶原酶消化法分离大鼠PASMCs，抗α-actin和α-SMA免疫组化染色鉴定。

2.2实验分组实验分组：①对照组：正常培养细胞；②ET-1组：对照组中加入10-7mol·L-1ET-1；③给药组：ET-1+PPⅦ (0.25、0.5、0.75 μmol·L-1)。分别于24、48、72 h收获细胞，检测各项指标。

2.3检测指标采用CCK-8法，筛选ET-1诱导大鼠PASMCs增殖的最佳浓度，同时按照“2.2”项分组，确定PPⅦ抑制PASMCs增殖的最佳浓度。使用Transwell迁移小室，检测细胞的迁移能力。采用 Annexin V-FITC/PI双染法检测PPⅦ处理大鼠PASMCs后凋亡情况。通过流式细胞术检测细胞周期的变化。

3 结果

3.1PASMCs的鉴定结果倒置显微镜下，大鼠PASMCs呈“谷”、“峰”状生长，特异性兔抗鼠α-actin和α-SMA单克隆抗体免疫荧光鉴定可见排列的束状肌丝被染色，证明培养细胞为平滑肌细胞。

3.2PPⅦ抑制PASMCs增殖诱导大鼠PAMCs增殖的最佳ET-1浓度为10-7mol·L-1。Tab 1结果显示，PPⅦ(0.25、0.50、0.75 μmol·L-1)浓度依赖性抑制ET-1诱导的PASMCs增殖(P<0.01)。

Tab 1 The proliferation inhibition rate of PASMCs treated with polyphyllin Ⅶ n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsET-1

3.3PPⅦ抑制PASMCs迁移Transwell结果显示(Tab 2)，ET-1处理后，大鼠PASMCs迁移率明显增加(P<0.01)。经PPⅦ(0.25、0.50、0.75 μmol·L-1)处理后，与ET-1组相比，PASMCs迁移率明显下降(P<0.01)，随时间和PPⅦ浓度的增加，PPⅦ抑制PASMCs迁移率越明显。

Tab 2 Cell migration with Transwell

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsET-1

3.4细胞周期分析ET-1处理大鼠PASMCs后，G0/G1期细胞比例较对照组明显减少(P<0.01)，S期和G2/M细胞比例较对照组明显增加(P<0.05)，G2/M期细胞比例较对照组差异无显著性。ET-1诱导的大鼠PASMCs经PPⅦ处理后，G0/G1期细胞比例明显增加(P<0.01)，与对照组相比差异无显著性；S期细胞较ET-1组降低(P<0.01)，与对照组相比差异无显著性；G2/M期细胞比例较对照组无明显差异，较ET-1组降低(P<0.05)。PPⅦ对大鼠PASMCs细胞周期的影响结果显示，用0.5 mol·L-1PPⅦ处理细胞48 h，抑制了ET-1诱导的PASMCs G0/G1期向S期的转化，抑制了S期向G2/M期的转化。

3.5细胞凋亡分析Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果显示，与对照组比较，ET-1处理大鼠PASMCs 48 h后，晚期凋亡细胞比例明显降低(P<0.01)，死亡细胞比例降低(P<0.05)。经PPⅦ 0.5 μmol·L-1处理48 h后，与ET-1组相比，PASMCs细胞总凋亡率明显升高(P<0.01)，正常细胞比例明显降低(P<0.01)。

4 讨论

PAH是临床众多心、肺疾病发生发展过程中重要的病理生理环节，研究表明PAH的发生机制复杂，PASMCs的异常增殖和迁移是PAH的主要发病机制。本文主要研究云南道地药材滇重楼中主要成分PPⅦ对ET-1诱导的大鼠PASMCs增殖和迁移的影响。结果显示，PPⅦ呈时间和浓度依赖性抑制ET-1诱导的大鼠PASMCs增殖和迁移。采用流式细胞仪检测PPⅦ处理后大鼠PASMCs细胞凋亡和细胞周期情况，发现PPⅦ处理后，PASMCs早期凋亡率和总凋亡率均明显升高，表明PPⅦ可通过诱导细胞凋亡，抑制ET-1诱导的G0/G1期向S期的转化，抑制S期向G2/M期的转化。实验结果为进一步深入研究PPⅦ在PAH防治中的作用及机制提供了实验依据。

(致谢:本实验是在昆明市延安医院中心实验室完成，感谢对实验给予帮助的老师和同学!)