白介素21在42日龄中国黄羽鹌鹑盲肠扁桃体中的定位

李 琴，何 敏，赵 飘，陈小梅，吕莹莹

(四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)

白介素21，即白细胞介素-21(interleukin-21，IL-21)，在2000年由Parrish-Novak等[1]发现，在激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化，信息传递及炎症反应中起重要作用。IL-21由活化的滤泡辅助性T(Tfh)细胞、CD4+T细胞和自然杀伤(NK)细胞分泌。IL-21与IL-2、IL-4、IL-15具有高度同源的四螺旋簇细胞因子结构域，是良好的免疫增强因子[1]。IL-21对不同阶段的T、B细胞和NK细胞均有调节作用，能促进T、B细胞和NK细胞增殖与分化，还可以增强NK细胞的杀伤活性[2]，在细胞免疫和体液免疫中起重要的调节作用[3]。张峰等[4]发现IL-21在炎症性肠病的慢性炎症中起调节作用，王燕等[5]推测IL-21在丝虫病、疟疾和利什曼病中起重要作用，魏丽丽等[6]发现IL-21在机体抗过敏、抗肿瘤方面发挥重要作用，王世杰等[7]与陈晚华等[8]在小鼠试验中发现了IL-21的抗肿瘤作用，刘艳等[9]发现IL-21对自身免疫病有效。目前， IL-21的研究主要集中在人类和哺乳动物上[4-10]。随着养禽业的发展和禽类疾病的频现，禽类免疫器官的研究显得十分重要。关于鸡和鸭免疫器官中IL-21的定位已有相关资料报道[10]，但在中国黄羽鹌鹑盲肠扁桃体中的定位还未见相关研究报道。

中国黄羽鹌鹑属隐性黄羽类型，是由岳根华于1990年发现并培育成功的，其成活率高，生长快，生长周期短，是一种具有较高经济价值的禽类[11]。鹌鹑的饲养量日益增加，但对鹌鹑的研究远没有达到其他家禽的深度[12]。盲肠扁桃体是禽类最大的肠相关性淋巴组织，位于回盲交接处，肉眼可见该处略微膨大[13]。盲肠扁桃体的免疫作用与法氏囊的退化密切相关，肠道末端的抗原处理主要由法氏囊完成，随着法氏囊退化，抗原处理转而由盲肠扁桃体来完成[14]。盲肠扁桃体属于外周淋巴组织，在外周淋巴组织中，生发中心是由抗原刺激产生的，盲肠扁桃体的生发中心主要由B淋巴细胞组成，上皮下固有层也存在大量B淋巴细胞[15]。T淋巴细胞在整个黏膜层分布，主要存在于黏膜固有层中下部，生发中心周围的滤泡间区域分布许多CD4+T淋巴细胞，CD8+T淋巴细胞主要分布在上皮下固有层[16-17]。盲肠扁桃体中T、B淋巴细胞的分布与其功能具有密切关系，可以更有效地抵御病原体的入侵。禽类各种组织结构基本达到成熟水平时，盲肠扁桃体的免疫功能基本成熟，可以提供足够的免疫保护作用[18]。鹌鹑在42日龄基本成熟，实验以此为切入点，运用免疫组织化学SABC法对42日龄中国黄羽鹌鹑盲肠扁桃体中IL-21的分布特点进行观察，探讨IL-21在盲肠扁桃体中的生理意义，为以后研究IL-21在鹌鹑体内如何发挥免疫效应提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验选用的10只42日龄健康中国黄羽鹌鹑(雌雄不分)，购自成都市新津县兴义镇广滩村彭定春养殖场。

1.2 主要试剂

兔抗IL-21多克隆抗体(ELA0Ab248)购自上海卡迈舒；即用型SABC(链霉亲和素-生物素复合物)试剂盒(SA1002-兔IgG)、DAB显色试剂盒(AR1022)，购自武汉博士德生物工程有限公司。SABC试剂盒包括5%BSA(牛血清白蛋白)封闭液、二抗(生物素化山羊抗兔IgG)、SABC试剂。

1.3 制片

将42日龄的中国黄羽鹌鹑称量后，剪舌下动脉处死，迅速取出盲肠扁桃体，放入Bouin’s固定液中24 h，固定好的材料流水冲洗24 h。常规脱水，透明，石蜡包埋。用LEICA RM 2135型石蜡切片机连续切片，片厚5～6 μm，贴片烘干。

1.4 染色方法

组织切片常规脱蜡复水，微波修复抗原，3%H2O2室温下作用20 min，以消除内源性过氧化氢酶活性。滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育30 min，加一抗，阴性对照组用PBS(磷酸缓冲盐溶液)代替一抗，4 ℃孵育17 h左右，依次加入二抗和SABC复合物，分别37 ℃孵育1 h、40 min，然后DAB显色。以上各步骤间均用PBS冲洗。苏木精染色，脱水，透明，封固。

1.5 结果分析

在普通光学显微镜下进行大体观察，确定IL-21在盲肠扁桃体中的分布情况与分布位置。然后应用Olympus BH-2显微镜观察，分别对每张切片在40倍、100倍物镜下随机摄取图像，用形态学图像分析软件对400倍镜下摄取的图像阳性反应强度进行半定量分析，测量IL-21阳性反应的平均光密度值(mean optical density， MOD)、积分光密度值(integral optical density， IOD)，以及平均灰度值(mean gray value， MGV)。

1.6 数据处理

用SPSS 20.0分析软件进行数据统计、分析。

2 结果与分析

2.1 IL-21免疫阳性反应细胞的组织学分布及形态特征

实验采用免疫组织化学SABC法观察，IL-21免疫阳性显色结果为棕黄色或棕褐色颗粒，阴性对照切片无阳性产物出现。光学显微镜下观察发现，中国黄羽鹌鹑盲肠扁桃体中阳性信号主要分布在固有层，黏膜上皮下固有层分布较多，棕黄色或棕褐色，圆形或近圆形，直径差异较大(图1-A～D)。阳性细胞在肠腺周围少量存在，棕黄色，锥形(图1-E)。生发中心周围的滤泡间区域有少量阳性细胞分布，阳性细胞近似圆形，棕黄色或棕褐色，直径较小(图1-F)。IL-21阳性反应产物在阳性反应细胞内清晰可见，极易辨别，阳性细胞核不是很明显。

2.2 IL-21阳性反应强度

平均光密度表示在视野内所有阳性细胞的平均反应强度，42日龄中国黄羽鹌鹑盲肠扁桃体中IL-21阳性细胞平均光密度为0.62±0.04，说明阳性细胞反应强度较大；积分光密度是表示整个视野内所有选定对象的反应强度的总和，积分光密度值高，表示总的反应强度大，实验测得IL-21阳性细胞积分光密度为9.90±2.34，说明鹌鹑盲肠扁桃体中IL-21阳性细胞总的反应强度大；阳性细胞平均灰度值越低，说明其免疫组化染色越深，本实验中IL-21平均灰度值为61.38±4.83，说明阳性细胞染色较深。

A， B， C中箭头示盲肠扁桃体黏膜上皮下固有层IL-21阳性反应；D中箭头1示盲肠扁桃体黏膜上皮下固有层IL-21阳性反应；箭头2示盲肠扁桃体肠腺周围IL-21阳性反应；E中箭头示盲肠扁桃体黏膜固有层中下部IL-21阳性反应；F中箭头示盲肠扁桃体生发中心周围IL-21阳性反应。400×。The arrow in A， B and C showed IL-21 positive reaction in the lamina propria of the underlying layer of the epithelium of cecal tonsil; the arrow 1 in D showed IL-21 positive reaction in the lamina propria of the underlying layer of the epithelium of cecal tonsil; the arrow 2 showed IL-21 positive reaction in intestinal gland of cecal tonsil; the arrow in E showed IL-21 positive reaction in the lower part of the lamina propria of cecal tonsil; the arrow in F showed IL-21 positive reaction in the germinal center of cecal tonsil. The magnification was 400×.图1 42日龄中国黄羽鹌鹑盲肠扁桃体Fig.1 Cecal tonsil of 42 day old Chinese Yellow Feather quail

3 讨论

3.1 中国黄羽鹌鹑盲肠扁桃体中IL-21分布

盲肠扁桃体的结构与派氏结相似，由密集型淋巴组织和弥散型淋巴组织组成[19]。盲肠扁桃体作为胃肠免疫系统的一部分，对肠道内细菌和其他抗原物质起着局部免疫的作用[20]。

光学显微镜下观察，中国黄羽鹌鹑盲肠扁桃体固有层均分布有IL-21阳性细胞，主要位于黏膜上皮下固有层，与董红艳等[14]及杨树宝等[15]认为盲肠扁桃体上皮下区域是B淋巴细胞依赖区域，进入盲肠的细菌及抗原经抗原呈递细胞转运到上皮下固有层中诱导B淋巴细胞形成特异性浆细胞，以及胡春蓉等[21]的IL-21可有效促进B淋巴细胞分化，形成浆细胞，分泌大量抗体的观点相符。Gómez等[16]与栾维民等[17]报道，生发中心主要由B淋巴细胞组成，其周围分布着许多CD4+T淋巴细胞。石荣亚[22]报道IL-21主要由活化的CD4+T细胞分泌，并且能够维持生发中心的形成。本研究观察到IL-21阳性细胞在生发中心周围少量存在，与以上观点相符。IL-21在盲肠扁桃体中分布与免疫细胞的分布及功能密切相关，与Glick等[19]发现CD4+T细胞主要聚集在黏膜层中下部生发中心的滤泡间区域、少量存在于生发中心，胡春蓉等[21]报道IL-21由活化的CD4+T细胞分泌，同时也可作为自分泌生长因子促进CD4+T细胞的增殖相符。Habib等[23]认为，IL-21在盲肠扁桃体中通过自分泌及旁分泌的方式调节T、B淋巴细胞增殖分化。

42日龄中国黄羽鹌鹑盲肠扁桃体中IL-21阳性细胞反应强度与逯志强[24]报道的鸵鸟胸腺、脾脏和腔上囊中IL-21阳性细胞反应强度差异较大，可能是动物种类、定位器官、操作方法等不同造成的。

3.2 中国黄羽鹌鹑盲肠扁桃体中IL-21功能

IL-21主要由CD4+T细胞、NK细胞、Tfh细胞及Tfh17细胞分泌，调节CD4+T细胞、B细胞的活化及增殖[9]。IL-21与IL-6在CD4+T细胞分化为Th17细胞过程中具有至关重要的作用。在体外，IL-21抑制FOXP3表达细胞的扩增，能促进初始CD4+T细胞向Th17细胞分化，从而促进CTL的扩增和活化，增强CTL的细胞杀伤活性[5]。易本谊等[25]发现，IL-21在免疫应答早期参与B细胞的活化，同时又诱导活化的B细胞凋亡，阻止过度的免疫反应发生，维持自稳平衡。刘志伟[26]认为，在机体的生理功能正常情况下，IL-21的表达量很少，而在活化的T淋巴细胞诱导下，IL-21的表达水平相对较高。魏丽丽等[6]报道IL-21介导先天性免疫向获得性免疫转换，从而在机体抗肿瘤方面发挥重要作用。吴申等[27]认为，IL-21可能通过刺激不同时期的NK细胞及T细胞增殖，促进IFN-γ的释放发挥抗肿瘤作用。IL-21在自身免疫疾病、肿瘤、寄生虫及肠炎等疾病中都发挥着重要作用[4-9]。IL-21在疾病治疗中的具体作用机制尚不清楚，还有待进一步研究。

IL-21在中国黄羽鹌鹑盲肠扁桃体中广泛存在，主要分布在黏膜上皮下固有层，阳性细胞的分布与免疫细胞的功能及分布密切相关。IL-21阳性反应强度可能受动物种类、定位器官和操作方法等因素影响。IL-21对免疫细胞具有调节作用，具体调节机制依赖于IL-21和其他信号的共同作用，在疾病的治疗中具有重要意义。