高效液相色谱法测定人血浆中两性霉素B的浓度Δ

叶珍洁，胡盈莹

(福建医科大学孟超肝胆医院药学部临床药学室，福建 福州 350002)

两性霉素B是广谱抗真菌药，主要通过与敏感真菌细胞膜上的甾醇结合，损伤膜的通透性，导致胞内物质外漏而发挥抗真菌作用[1]。近年来，随着广谱抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂及细胞毒性药物的广泛应用，深部真菌感染的发生率不断升高。两性霉素B为临床上抗深部真菌感染的一线用药，抗真菌谱广，抗菌作用强，然而，该药引发肾损伤的发生率高，其肾毒性大多与药物蓄积相关[2]，剂量较大时可导致不可逆的急性肾衰竭[3-4]。临床上可对重症真菌感染、肾功能不全及儿童患者[5]等进行两性霉素B血药浓度监测并根据结果及时调整药物剂量，实现个体化治疗，可提高药物疗效并减少对肝、肾等的毒性。本研究建立了快速、简便、专属性强且重现性好的两性霉素B高效液相色谱检验法，可用于两性霉素B的血药浓度监测及药动学研究。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(G1311C四元泵、G1329B进样器、G1316A可调柱温恒温箱及G1314F紫外检测器)购自Agilent公司；BSA224S-CW型分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；Legend Micro21R型高速离心机(Thermo公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MS3 Basic型涡旋混合器(德国IKA公司)。

1.2 药品与试剂

两性霉素B标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司，批号：C10243050)；磷酸二氢钾(国药集团化学试剂有限公司，批号：20140102，分析纯)；冰乙酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：A116174，色谱纯)；三乙胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：T103287，色谱纯)；乙腈(德国默克公司，色谱纯)；水为重蒸去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Aglilent C18反向色谱柱(LiChrosorb 100 RP-18，200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.01 mol/L KH2PO4溶液(1%三乙胺，冰醋酸调节pH至5.0)(V∶V=60∶40)；柱温：25 ℃；流速：1 ml/min；紫外检测波长：410 nm；进样量：100 μl。

2.2 样品的制备

2.2.1 标准品储备液、标准品工作液及质控样品工作液：精密称取两性霉素B标准品0.01 g于1.5 ml Eppendorf管(EP管)中，取二甲基亚砜1 ml完全溶解，后将该溶解液移至100 ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制得质量浓度为100 μg/ml的标准品储备液，用乙腈分别稀释为60.0、30.0、20.0、10.0、5.0、2.5及0.5 μg/ml的标准品工作液，避光储存于-20 ℃冰箱中。将标准品储备液用乙腈稀释为50.0、12.5及1.25 μg/ml的质控样品工作液，避光储存于-20 ℃冰箱。

2.2.2 血浆样品前处理：取待测血样[第5剂给药前0.5 h收集的血浆样品，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝]1.5～2.0 ml，3 000 r/min离心10 min，取上清血浆400 μl，加入乙腈沉淀蛋白400 μl，涡旋振荡5 s，静置5 min待蛋白完全沉淀后，在13 000 r/min、4 ℃下离心10 min，取上清液过0.22 μm的微孔滤膜，滤液置于1.5 ml EP管中待测。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验：取空白血浆400 μl置于1.5 ml EP管中，按“2.2.2”项下方法进行蛋白沉淀并过滤待测；取空白血浆320 μl置于1.5 ml EP管，加入12.5 μg/ml的标准品80 μl，即得两性霉素B质量浓度为2.5 μg/ml的血浆溶液，按“2.2.2”项下方法进行蛋白沉淀并过滤待测；取待测血浆400 μl，按“2.2.2”项下方法进行蛋白沉淀并过滤。3个样品按“2.1”项下色谱条件进样测定，色谱图见图1，两性霉素B的出峰时间约为5.5 min。结果表明，空白血浆内源物质不干扰两性霉素B的测定，本方法具有较高的专属性。

A.空白血浆；B.空白血浆+两性霉素B(2.5 μg/ml)；C.待测血浆A. blank plasma; B. blank plasma + AmB(2.5 μg/ml); C. plasma to be tested图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.2 标准曲线及定量下限的测定：取空白血浆320 μl置于1.5 ml EP管中，加入标准品工作液80 μl分别得12.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5及0.1 μg/ml的标准品工作液，按“2.2.2”项下方法预处理后，依次进样测定[6]。以样品峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得回归方程Y=264.54X-6.358 6，r=0.999 8。两性霉素B血药浓度在0.1～12.0 μg/ml范围内线性良好。两性霉素B血浆样品的定量下限为0.1 μg/ml，平行对5个质量浓度为0.1 μg/ml 两性霉素B的血浆样品进行测定，平均回收率为98.23%，准确度良好，RSD=5.64%<20%，精密度良好。

2.3.3 精密度试验：用空白血浆配制低(0.25 μg/ml)、中(2.5 μg/ml)及高(10.0 μg/ml)3个血药浓度的两性霉素B血浆溶液，日内连续测3次，计算日内精密度；连续测定3 d，计算日间精密度[6]。低、中及高浓度的日内及日间精密度的RSD均<15%，精密度良好，见表1。

2.3.4 稳定性试验：用空白血浆配制低(0.25 μg/ml)、中(2.5 μg/ml)及高(10.0 μg/ml)3个血药浓度的两性霉素B血浆溶液，分为3组，分别测定室温(25 ℃)避光放置2、4 h，-20 ℃冻存1、3 d，冻融1次和3次的稳定性[6]。结果显示，低(0.25 μg/ml)、中(2.5 μg/ml)及高(10.0 μg/ml)血药浓度两性霉素在3种条件下测定结果与标示浓度比较，RSD均<15%，方法稳定性良好，见表2。

表1两性霉素B日内、日间精密度试验结果
Tab1Inter-dayandintra-dayprecisiontestofamphotericinB

浓度/(μg/ml)日内精密度(n=5)日间精密度(n=5)实测浓度/(μg/ml)RSD/%实测浓度/(μg/ml)RSD/%0.250.242±0.0125.110.243±0.0114.752.52.43±0.031.372.45±0.052.0010.09.70±0.121.239.80±0.151.53

表2不同质量浓度两性霉素B的稳定性结果
Tab2StabilityofdifferentconcentrationsofamphotericinB

实验条件时间0.25 μg/ml2.5 μg/ml10.0 μg/ml实测浓度/(μg/ml)RSD/%实测浓度/(μg/ml)RSD/%实测浓度/(μg/ml)RSD/%室温避光2 h0.232.232.391.139.341.634 h0.223.222.322.349.061.78血浆冰冻1 d0.242.532.431.329.671.653 d0.232.342.411.519.521.98血浆冻融1次0.242.252.441.329.611.153次0.243.682.461.379.771.32

2.3.5 准确度试验：用空白血浆配制低(0.25 μg/ml)、中(2.5 μg/ml)及高(10.0 μg/ml)3个血药浓度的两性霉素B血浆溶液，每个样品连续测定5次，计算准确度[6]。结果显示，低(0.25 μg/ml)、中(2.5 μg/ml)及高(10.0 μg/ml)血药浓度的两性霉素B准确度分别为95.86%、96.19%及96.97%，介于100%±15%之间，且RSD均<15%，准确度良好，见表3。

表3两性霉素B准确度试验结果
Tab3AccuracytestofamphotericinB

质量浓度C/(μg/ml)回收率/%RSD/%0.2595.863.752.596.192.0010.096.971.53

2.3.6 质控样品的监控：每次进行血样浓度测定时，均检测标准品工作液及血浆质控样品，应保证标准品工作液回算血药浓度在标示值的±15%范围内，定量下限应在±20 %范围内，且低、中及高浓度的血浆质控样品准确度应<±15%，方可保证待测血样检测浓度可信[6]。

3 讨论

3.1 两性霉素B的物理性质

两性霉素遇光遇热易分解，且其稀释溶液对光尤为敏感[7]，故两性霉素B标准品的保存及实验操作过程均应避光。仅采取冷藏保存措施时，两性霉素B在1个月后峰面积降低>50%[8]。实验过程中应冰上操作以减少两性霉素降解，血浆样品置于-80 ℃保存比置于-20 ℃更加稳定[9]。

3.2 检测波长的选择

将两性霉素B标准品进行全波长扫描，发现其最大吸收波长为410 nm，与文献报道一致[10-11]，故选择410 nm作为两性霉素B的检测波长。

3.3 流动相的选择

采用乙腈-醋酸铵水溶液(pH=4.8)[8]、乙腈-甲醇-醋酸铵[3]、乙腈-冰醋酸-水[12]做流动相时，不同配比或梯度洗脱均有拖尾或峰形对称度不佳等情况，于是改用乙腈-0.01 mol/L KH2PO4作为流动相[13]。当流动相为乙腈-0.01 mol/L KH2PO4(V∶V=60∶40)，流速为1.0 ml/min，柱温为25 ℃时，峰宽窄且峰形较好，出峰时间理想，约为5.5 min，后加入1%三乙胺并用冰醋酸调节pH改善峰形对称度，当pH=5.0时，峰形对称度最佳，故采用此色谱条件。

3.4 血浆预处理的选择

试用甲醇、乙腈作为血浆蛋白沉淀剂，经过对比发现，乙腈作蛋白沉淀剂时，杂质较少且提取回收率高，即乙腈的蛋白沉淀率较甲醇高。此外，亦有文献采用固相萃取法[1,14-15]进行血浆预处理，但固相萃取法步骤繁琐，回收率较乙腈沉淀法低，且成本较高[8]。经过比较，采用便捷、经济且回收率较高的乙腈沉淀法进行血浆预处理。

本检测方法为外标法高效液相检测法，便捷、经济且准确，但仍存在一定的样本间操作误差。两性霉素B常用于隐球菌性脑膜炎，常需检测脑脊液中两性霉素B的浓度，因血-脑脊液屏障作用，脑脊液中两性霉素B的浓度较低，低于本方法检测下限。为减少样本间操作误差、进一步提高检测准确度与精密度，可考虑采用液相色谱质谱联用内标法、超高压液相色谱-二级管阵列检测器[16]等方法进行检测。

综上所述，本方法前处理操作简单、快速且经济，检测结果精密度、稳定性良好，回收率高，可用于临床常规两性霉素B血药浓度监测和药动学研究。