CA—9在早期乳腺癌前哨淋巴结中的表达及其生物学意义

杨怀才　余文洁　骆国英　赖兆泳

【摘要】 目的：研究前哨淋巴结中缺氧相关蛋白碳酸酐酶-9（carbonic anhydrase-9，CA-9）的表达与早期乳腺癌淋巴结转移的关系。方法：选取2013年1月-2017年12月在本院全程治疗的乳腺癌患者46例，运用免疫组化的方法检测患者前哨淋巴结石蜡标本中的CA-9的表达，分析CA-9与早期乳腺癌临床病理因素的关系。结果：46例乳腺癌中，前哨淋巴CA-9阳性率为19.57%（9/46）；其中淋巴结有转移的CA-9阳性率为88.89%（8/9），明显高于淋巴结无转移的2.7%（1/37），比较差异有统计学意义（P<0.05）；临床分期Ⅱb、Ⅱa、Ⅰ、0期的CA-9阳性率分别为100%（6/6）、13.64%（3/22）、0、0，比较差异有统计学意义（P<0.05）；但CA-9阳性与患者月经状况、原发肿瘤大小、病理类型、ER、PR、CerbB-2、Ki-67无关（P>0.05）。结论：前哨淋巴结中CA-9的表达与早期乳腺癌的腋窝淋巴结转移相关，其表达随临床分期的升高而明显增加，但与患者月经情况、肿瘤大小、病理类型、ER、PR、CerbB-2、Ki-67无关。

【关键词】 早期乳腺； CA-9； 前哨淋巴结； 淋巴结转移

【Abstract】 Objective：To investigate the relationship between carbonic anhydrase-9（CA-9） expression in sentinel lymph nodes and early breast cancer lymph node metastasis.Method：A total of 46 patients with breast cancer who were treated in our hospital from January 2013 to December 2017 were selected，the expression of CA-9 in the paraffin samples of sentinel lymph nodes was detected by immunohistochemistry，the relationship between CA-9 and the clinicopathological factors of early breast cancer were analyzed.Result：In 46 cases of breast cancer，the positive rate of sentinel lymphatic CA-9 was 19.57%（9/46）.Among them，the positive rate of CA-9 with lymph node metastasis was 88.89%（8/9），which was significantly higher than 2.7%（1/37） of lymph nodes without metastasis，the difference was statistically significant（P<0.05）.The positive rate of CA-9 in clinical stage Ⅱb，Ⅱa，Ⅰ and 0 was respectively 100%（6/6），13.64%（3/22），0 and 0，the difference was statistically significant（P<0.05）.But positive CA-9 was not associated with the patients menstrual status，primary tumor size，pathological type，ER，PR，CerbB-2 and Ki-67（P>0.05）.Conclusion：The expression of CA-9 in sentinel lymph nodes was correlated with axillary lymph node metastasis of early stage breast cancer，and its expression was significantly increased with the increase of clinical stage，but it was not related to the patients menstrual situation，tumor size，pathological type，ER，PR，CerbB-2 and Ki-67.

【Key words】 Early breast cancer； CA-9； Sentinel lymph node； Lymph node metastasis

First-authors address：Maternal and Child Health Hospital of Qingyuan City，Qingyuan 511500，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.22.012

乳腺癌的發病率呈逐年上升趋势，已成为女性发病率最高的一种恶性肿瘤（占23.0%），同时也是导致女性恶性肿瘤死亡的主要原因（占14.0%）[1]。乳腺癌淋巴结状况是影响患者生存的非常重要的预后因素，有研究报道，早期乳腺癌淋巴结转移的发生率在20%～30%[2-3]。有很多因素会影响淋巴结的转移，其中缺氧是决定肿瘤发生和转移的关键因素。缺氧往往意味着肿瘤预后差，缺氧相关蛋白碳酸酐酶-9（carbonic anhydrase-9，CA-9）与肿瘤缺氧有关，可调节细胞内pH值，与肿瘤细胞增殖、细胞黏附、肿瘤进展相关[4-5]。有研究指出，CA-9的表达是早期乳腺癌前哨淋巴结转移的独立高危因素之一[6]。但国内有关CA-9在前哨淋巴结中的表达与早期乳腺癌腋窝转移的关系的研究非常少。本研究通过免疫组化的方法研究CA-9在早期乳腺癌前哨淋巴结中的表达，分析其与乳腺癌临床病理指标的关系，为乳腺癌前哨淋巴结活检的应用提供新的检测指标，避免假阴性给患者预后带来的风险。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月-2017年12月在本院乳腺外科全程治疗的乳腺癌患者。纳入标准：临床分期为早期乳腺癌（TisN0M0及T1-2N0-1M0，后者包括Ⅰ期、Ⅱa期、Ⅱb期中仅T2N1M0）的患者。排除标准：多中心、多发病灶；患侧已行乳腺或腋窝手术或放疗；哺乳期乳腺癌；示踪剂过敏者；炎性乳癌。术前用美兰行前哨淋巴结染色，将以下二种情况的淋巴结（沿蓝染淋巴管解剖至蓝染的淋巴结、术中扪及到肿大质硬的淋巴结）均作为前哨淋巴结一并切除送石蜡病检。共获得手术石蜡包埋标本46例，有完整的临床及病理资料，患者均为女性，年龄30～64岁，平均47岁；绝经前患者28例，绝经后患者18例；临床分期0期7例，Ⅰ期11例，Ⅱa期22例，Ⅱb期6例；原位癌7例，浸润性导管癌37例，黏液癌2例；淋巴结有转移9例，无转移37例；雌激素受体（ER）阴性12例，阳性34例；孕激素受体（PR）阴性15例，阳性31例；CerbB-2种原癌基因阴性27例，阳性19例；Ki-67增殖指数≤14% 16例，14%

1.2 方法 将46例早期乳腺癌前哨淋巴结石蜡切片脱蜡水化后，灭活内源性过氧化物酶，微波法修复抗原，采用EnVision法（免疫酶标方法）检测CA-9表达，分别在低倍镜及高倍镜下观察组织切片，镜下组织细胞结构清晰，细胞膜和细胞质内均有黄色颗粒沉着，着色明显高于背景为阳性表达细胞，分析CA-9與早期乳腺癌临床病理因素的关系。

1.3 统计学处理 使用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

46例乳腺癌中，前哨淋巴CA-9阳性率为19.57%（9/46）；其中淋巴结有转移的CA-9阳性率为88.89%（8/9），明显高于淋巴结无转移的2.7%（1/37），比较差异有统计学意义（P<0.05）；临床分期Ⅱb、Ⅱa、Ⅰ、0期的CA-9阳性率分别为100%（6/6）、13.64%、0、0，比较差异有统计学意义（P<0.05）。但CA-9阳性与患者月经状况、原发肿瘤大小、病理类型、ER、PR、CerbB-2、Ki-67无关（P>0.05）。见表1。

3 讨论

缺氧是导致肿瘤发展的最常见的肿瘤微环境之一[7]。缺氧诱导因子-1（Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是一种可被缺氧激活的转录因子，在许多肿瘤组织中过表达，是肿瘤适应缺氧微环境的关键调节因子[8]。在缺氧状态下，HIF-1表达稳定，可诱导一系列基因的表达，以支持肿瘤的生存，其中就包括CA-9[9]。CA-9是人类发现的15种碳酸酐酶家族中的一员，包括胞外活性位点结构域和蛋白多糖样氨基端，是一种可催化二氧化碳快速生成碳酸氢盐和质子的膜金属酶，是消除糖酵解所产生的酸性负荷所必需的[10]。因此，CA-9在维持细胞与细胞外间隙的pH梯度方面起着重要的作用。癌症往往表现出肿瘤代谢异常，其典型的特征是依赖糖酵解而不是氧化磷酸化。这种异常代谢所产生的乳酸量增加，迫使肿瘤细胞发生一系列的适应反应，以避免酸中毒和细胞内pH的紊乱[11]。碳酸酐酶家族通过促进质子消除和再循环利用碳酸氢盐参与到这一过程中。

在一般情况下，CA-9很少在正常组织中表达[12]，并且与细胞缺氧直接相关，在肿瘤中的表达仅限于坏死区或低氧区。CA-9可在卵巢癌、乳腺、结肠和宫颈的缺氧肿瘤中高度表达[13-15]。这可能是由于肿瘤细胞不被控制的过度增殖，而血管供氧不能相应增加导致缺氧微环境。细胞内pH值对肿瘤细胞的生长和存活起着重要的调节作用，而CA-9可调节细胞内pH。同时CA-9还可通过增加肿瘤细胞的运动能力、侵袭性和转移性来促进肿瘤的发展。

有研究指出，CA-9在乳腺癌中的表达随转移和临床分期升高而增强，并是乳腺癌的预后因素之一[16]。多项研究表明，CA-9与乳腺癌的侵袭性密切相关。有学者研究CA-9的表达及其在乳腺癌分子分型中的重要性，通过免疫组织化学方法检测117位乳腺癌患者ER、PR、HER-2、CK5/6、EGRF和CA-9的表达，结果显示，CA-9的表达不仅与乳腺癌分子分型有关，还与肿瘤分级、激素受体、大体标本的直径相关，提示CA-9是乳腺癌预后不良的一个独立指标[17]。文献[18]报道，CA-9是晚期乳腺癌患者生存不良的标志。多项研究发现，肿瘤细胞中CA-9的表达与淋巴结转移有关。Amatsu等[10]发现乳腺癌穿刺活检标本中CA-9的表达与淋巴结转移和淋巴血管浸润显著相关。Schütze等[19]用TMA检测CA-9 mRNA信号强度，发现CA-9高表达意味着存在淋巴结转移及无病生存期较短。

本研究结果显示，46例乳腺癌中，前哨淋巴CA-9阳性率为19.57%（9/46），其中淋巴结有转移的CA-9阳性率为88.89%（8/9），明显高于淋巴结无转移的2.7%（1/37），比较差异有统计学意义（P<0.05），考虑前哨淋巴结CA-9的表达可提示早期乳腺癌已发生淋巴结转移；临床分期Ⅱb、Ⅱa、Ⅰ、0期的CA-9阳性率分别为100%（6/6）、13.64%、0、0，比较差异有统计学意义（P<0.05），表明CA-9在前哨淋巴结中的表达随临床分期的升高而明显增加，但CA-9的表达与患者的月经状况、病理分型、肿瘤大小、ER、PR、CerbB-2、Ki-67状况无明显关系（P>0.05）。已经有研究报道，CA-9的表达是早期乳腺癌前哨淋巴结转移的独立高危因素之一[16]，这与本研究的结果相似。在前哨淋巴结中CA-9高表达预示着淋巴结发生转移的可能性非常大，表明即使是早期乳腺癌，前哨淋巴结中CA-9高表达，也应进行乳腺癌腋窝淋巴结清扫术，从而减少复发；研究发现，CA-9的表达还与激素受体、大体标本的直径、Ki-67相关[16]，但在本研究中CA-9的表达与患者的肿瘤大小、ER、PR、CerbB-2、Ki-67无明显关系，考虑可能与本研究样本量较小有关，可在今后的临床工作中继续收集相关标本，进行CA-9的检测。

综上所述，前哨淋巴结中CA-9的表达与早期乳腺癌的淋巴结转移相关，其表达随临床分期的升高而明显增加，但与患者月经情况、肿瘤大小、病理类型、ER、PR、CerbB-2、Ki-67无关。

参考文献

[1]汪满金，俸瑞发.乳腺癌前哨淋巴结活检的研究进展[J].中国普外基础与临床杂志，2014，21（12）：1587-1592.

[2]杨振林.乳腺癌前哨淋巴结研究的现状与评价[J/OL].中华临床医师杂志（电子版），2015，9（6）：893-897.

[3]王琰娟，米成嵘，王文.乳腺癌前哨淋巴结的超声造影检查及与乳腺癌组织 ER、PR和HER-2表达的相关性[J].宁夏医科大学学报，2013，35（5）：528-531.

[4]杨后圃，王殊.转化医学助力21世纪的乳腺癌研究[J/OL].中华乳腺病杂志（电子版），2014，8（1）：9-12.

[5]刘丹，马晓红，李杰，等.碳酸酐酶-9与妇科肿瘤的研究进展[J].中国生育健康杂志，2016，27（3）：293-295.

[6] Eom K Y，Jang M H，Park S Y，et al.The Expression of Carbonic Anhydrase（CA） Ⅸ/Ⅻ and Lymph Node Metastasis in Early Breast Cancer[J].Cancer Res Treat，2016，48（1）：125-132.

[7] Chu C Y，Jin Y T，Zhang W，et al.CA Ⅸ is upregulated in CoCl2-induced hypoxia and associated with cell invasive potential and a poor prognosis of breast cancer[J].Int J Oncol，2016，48（1）：271-280.

[8]司瑞丽，李晓凤.缺氧诱导因子1与肿瘤相关性的研究进展[J].医学综述，2016，22（7）：1287-1291.

[9]周文芳，徐方云.缺氧诱导因子-1与肿瘤关系的研究进展[J].南昌大学学报（医学版），2017，57（3）：87-90.

[10] Aomatsu N，Yashiro M，Kashiwagi S，et al.Carbonic anhydrase 9 is associated with chemosensitivity and prognosis in breast cancerpatients treated with taxane and anthracycline[J].BMC Cancer，2014，14：400.

[11]冷婕，吴斌.碳酸酐酶Ⅸ与乳腺癌[J/OL].中华乳腺病杂志（电子版），2014，8（6）：423-427.

[12]唐江华，周维.CXCL9和碳酸酐酶Ⅸ在鼻咽癌患者血清中的表达及其临床意义[J].实用癌症杂志，2016，31（11）：1795-1798.

[13]郭苏阳，赵燕，李胜泽.缺氧相关蛋白碳酸酐酶-Ⅸ在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义[J].蚌埠医学院学报，2014，39（4）：442-444.

[14]李红，李园，郗洪庆.缺氧相关蛋白碳酸酐酶-9在结直肠癌的表达及生物学意义[J].解放军医学院学报，2011，32（5）：504-505.

[15]马宗丽，仲建新.缺氧诱导因子1α和碳酸酐酶Ⅸ在宫颈上皮癌变过程中的表达及意义[J].江苏医药，2014，40（8）：903-905.

[16]孙吉瑞，周炳娟，陈红，等.HIF-1α和CA9在乳腺癌中的表达及其与基底细胞样型乳腺癌的关系[J].国际肿瘤学杂志，2017，44（6）：415-419.

[17]李美平，任丽芳，蔡红光，等.碳酸酐酶Ⅸ蛋白在乳腺癌分子分型中的表达及其意义[J].中华病理学杂志，2013，42（3）：182-185.

[18] Vidlickova I，Dequiedt F，Jelenska L，et al.Apoptosis-induced ectodomain shedding of hypoxia-regulated carbonic anhydrase Ⅸ from tumorcells：a double-edged response to chemotherapy[J].BMC Cancer，2016，16：239.

[19] Schütze D，Milde-Langosch K，Witzel I，et al.Relevance of cellular and serum carbonic anhydrase IX in primary breast cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，2013，139（5）：747-754.

（收稿日期：2018-04-20） （本文編辑：董悦）