mTOR信号通路的激活在左旋多巴诱发异动症中的作用及机制研究

柳学勇　陈小武

【摘要】 目的：探討mTOR信号通路的激活在左旋多巴诱发异动症（L-dopa induced dyskinesia，LID）中的作用及可能机制。方法：60只普通雄性大鼠，其中选取10只作为健康对照组，皮下注射安慰剂葵花油2 mg/kg；其余50只采用鱼藤酮2 mg/kg，颈背部注射，以大鼠行为变化2～6分选为PD组；PD组大鼠L-dopa 10 mg+Benserazide诱导，制备LID模型，最终大鼠模型对照组（n=10），PD组（n=10），LID组（n=14）。Western Blot技术检测大鼠纹状体S6K的Thr389、S6Ser240/244表达及mTOR的蛋白活性（p70S6K）及免疫组织化学检测AMPA受体亚基GluR1、GluR2水平。结果：LID组大鼠Thr389、S6Ser240/244、代表mTOR蛋白活性p70S6K表达及GluR1、GluR2阳性细胞数均明显高于PD组及对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；PD组大鼠Thr389、S6Ser240/244、代表mTOR蛋白活性p70S6K表达及GluR1、GluR2阳性细胞数均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：mTOR信号通路激活参与了PD及LID的发病，mTOR信号通路激活Thr389位点，进而激活S6K，引发S6Ser240/244激活，导致PD、LID的发生及进展。而且mTOR激活后，AMPA受体亚基GluR1、GluR2功能增强，对LID的发生也具有促进作用。

【关键词】 mTOR； 帕金森； 左旋多巴； 异动症； S6K； AMPA

【Abstract】 Objective：To explore the role and possible mechanism of activation of mTOR signaling pathway in Levodopa induced dyskinesia. Method：A total of 60 normal male rats，10 of them were selected as healthy control group and subcutaneously injected with placebo sunflower oil for 2 mg/kg.The other 50 rats were injected rotenone 2 mg/kg and neck back injection，and PD group was selected for 2-6 points of rat behavior change. PD group rats were induced by L-dopa 10 mg+Benserazide，and LID model was prepared.Finally，rat model control group （n=10），PD group （n=10），LID group.The Thr389 and S6Ser240/244 expression of S6K in the striatum and the protein activity of mTOR （p70S6K） were detected by Western Blot technique，the level of AMPA receptor subunit GluR1 and GluR2 were detected by immunohistochemistry.Result：The expression of Thr389， S6Ser240/244，P70S6K representing the activity of mTOR protein and the positive cells numbers of GluR1 and GluR2 in LID group were significantly higher than those in PD and control group，the differences were statistically significant （P<0.05）.The expression of Thr389， S6Ser240/244，P70S6K representing the activity of mTOR protein and the positive cells numbers of GluR1 and GluR2 in PD group were significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant （P<0.05）.Conclusion：The activation of mTOR signaling pathway is involved in the pathogenesis of PD and LID.The mTOR signaling pathway activates the Thr389 site，then activates S6K，triggering the activation of S6Ser240/244，leading to the occurrence and development of PD and LID.After mTOR activation，the function of AMPA receptor subunit GluR1 and GluR2 were increased，which also promoted the occurrence of LID.

【Key words】 mTOR； Parkinson； Levodopa； Dyskinesia； S6K； AMPA

First-authors address：University of Chinese Academy of Sciences Shenzhen Hospital，Shenzhen 518106，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.22.002

帕金森病（Parkinsons disease，PD）为神经科临床常见病，其以中脑多巴胺能神经元的变性死亡为主要的病理改变。随后纹状体多巴胺含量显著性减少，从而致病出现临床症状。但目前，导致此病理改变的确切病因仍不甚清楚。目前的研究提示，年龄老化、遗传因素、氧化应激、环境等因素均可能参与此病例变化过程，可能为多因素的机制。左旋多巴（L-dopa）是临床治疗PD的主要药物之一，然而有文献报道显示L-dopa在治疗PD患者5年后，超过50%疗效减退，且引发了运动并发症—异动症（L-dopa induced dyskinesia，LID），此并发症难以控制[1]。LID一旦出现将长期存在，临床处理非常困难[2]，后续治疗费用十分高昂。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要通过下游两个效应分子真核细胞翻译启始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）和p70核糖体S6蛋白激酶（p70S6K）控制mRNA的起始翻译，调节蛋白质的合成。蛋白质的合成是一个受到高度调节的过程，目前所知的大多数翻译调节机制发生在蛋白质的起始翻译阶段。而mTOR是蛋白质的起始翻译阶段最主要的调节信号分子。大量研究资料表明，mTOR调节的蛋白质的合成在突触可塑性调节中发挥着重要的作用。研究发现，mTOR不仅在NMDA受体依赖的LTP起重要作用，同时在mGluR依赖的LTD（long-term depression）中发挥作用[3]，研究还发现mTOR、eIF4E（真核细胞翻译启始因子4E）以及4E-BP与突触后标志物共存，强烈提示了依赖于mTOR翻译机制的突触可塑性调节[4]。目前mTOR的激活是如何导致皮质纹状体突触的“病理性”尚未明确。本研究以大鼠模型研究左旋多巴诱发异动症与mTOR信号通路的激活的关系，从而探讨其作用及可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器 材料：健康雄性大鼠60只，体质量200～300 g（广州医学院）。试剂：葵花油、鱼藤酮均购于达安基因公司。阿扑吗啡、L-dopa、Benserazide均购于美国sigma公司。RIPA裂解液（碧云天公司，中国）、LC3多克隆抗体（Abcam，英国）。p70S6K多克隆抗体（Protein tech，美国）、Thr389（Protein tech，美国）、S6Ser240/244（Protein tech，美国）、GAPDH多克隆抗体（華安生物，杭州）、ECL增强型化学发光试剂盒、PVDF膜（Millipore，美国）。仪器：脑立体定位仪（日本Narishige公司），EG1150H型组织包埋机（德国Leica公司），TS-1脱色摇床（上海禾颖仪器表制造研究所）。

1.2 模型制作 所有健康雄性大鼠均由专业动物饲养员喂养，温度控制在20～25 ℃，湿度控制在55%～65%，昼夜光线每12小时交替，喂养2周后，开展PD及LID大鼠模型制作。60只大鼠中随机选取10只作为健康对照组，皮下注射安慰剂葵花油2 mg/kg，直至实验结束；余50只大鼠首先制备PD模型。PD大鼠于颈背部皮下注射鱼藤酮2 mg/kg，连续1周，根据大鼠行为变化分为6个等级：10分：濒临死亡状态；8分：单侧前肢或后肢瘫痪，四肢痉挛，体重较前减轻且>50%，无法进食；6分：单侧前肢或后肢瘫痪，出现行走困难，且体重较前减轻>30%且≤50%，进食减少且困难；4分：自主活动较前减少，出现步态不稳或震颤，行走缓慢，且单侧斜卧，体重较前减轻>20%且≤30%；2分：拒捕行为较前减弱，毛色变黄，毛质变软，出现动作缓慢，轻度震颤或步态不稳，体重较前减轻>10%且≤20%；1分：拒捕行为，色变黄，毛质变软，活动减少，体重减轻<10%。以大鼠行为评分2～6分作为PD纳入标准，共36只大鼠成功制备PD模型。成功制备PD模型3 d后，选取26只大鼠作为LID组大鼠模型，采用乙醚麻醉待手术后大鼠，脑立体定向仪将大鼠头颅固定在操作台上，头顶及后脑备皮，经大脑后正中线剪约2 cm刀口，眼科镊分离皮下组织，采用纱布蘸取生理盐水擦拭前囟，灭菌玻璃微量吸液管通过长管注射器链接，经大鼠前囟左或右0.9 mm，下1.5 mm，穿刺渗透大鼠头骨2～3 mm，

5 min后缓慢注入L-dopa 10 mg+Benserazide 3.0 mg/kg，

连续2 d，1次/d，评定结果须达到异动症（AIM）评分标准。异动症（AIM）评分参考Monville标准，共由4个部分组成：轴性即颈部和对侧上体出现扭曲姿势；口面部即下颌运动及舌头向口外伸出；运动即与对侧出现转向运动；上肢即对侧前肢出现重复无目的动作[5]。据此进行评定，数据顺序亦按此进行记录，每部分的评分等级根据行为学的有无及不自主运动的严重程度来划分。采用link评分法分为5级：4分为持续存在，刺激不可使之停止；3分为继续存在，刺激可以停止；2分为经常出现，超过50%的观察时间；1分为偶尔出现，少于50%的观察时间；0分为未出现。LID模型成功标准：以30 min为观察时间，分3次进行，均在给药后观察获得AMI评分，AMI评分中4项评分均≥1分作为LID大鼠成功制备标准。

1.3 Western Blot技术检测大鼠纹状体S6K的Thr389、S6Ser240/244表达及mTOR的蛋白活性 三组大鼠均在药物干预最后1 d准备冻存管，三组大鼠在末次用药2 h后快速断头，置于冰上小心操作，解剖出右侧纹状体后，立刻称重并记录，采用液氮快速冻存。依据大鼠的总重量配置RIPA裂解液量，加入RIPA裂解液，研磨，提取蛋白，BCA法定量后采用SDS-PAGE凝胶电泳，湿转转膜法转到PVDF膜上（100 V，120 min），5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，加入Thr389（1︰10 000）、S6Ser240/244（1︰10 000）抗体、p70S6K（1︰1 000）、GAPDH抗体（1︰2 000），4 ℃恒温下孵育过夜。TBST洗膜3次，用时10 min/次，加入HRP标记的二抗（1︰5 000），37 ℃恒温下孵育1 h，TBST洗膜，ECL化学发光法发光，经凝胶成像系统扫描目的条带后分析，以GAPDH作为内参照，以阳性条带/GAPDH条带光密度比值作为蛋白的相对表达量，测定获得Thr389、S6Ser240/244表达水平及p70S6K的蛋白活性。

1.4 免疫组织化学检测AMPA受体亚基GluR1、GluR2水平 取保存好的大鼠纹状体石蜡切片，中温50 ℃烘烤溶解，冷却后酒精去蜡，置于蒸馏水中清洗15 min后以高温75 ℃浸泡15 min，然后以PBS漂洗3次，置于准备好的试管中以封闭液封闭。2 h后滴入单抗GluR1（1︰50）、GluR2（1︰3 000），4 ℃孵育过夜。37 ℃保温半小时，取出PBS漂洗3次，然后滴入IgG抗体（1︰200）150 ?L，置于室温中，2 h后PBS漂洗3次，玻片滤干后室温下滴入显色剂，首次染色完毕后漂洗，滴入第二次显色剂，室温干燥过夜，脱水后以pH 7.0树脂封玻片，在光学显微镜下高倍视野观察GluR1、GluR2阳性细胞。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件，对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用F检验；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型制备情况 对照组10只大鼠均完成各项实验研究；50只研究组大鼠成功制备为PD模型36只，36只PD模型大鼠中26只用于LID模型制备，成功14只。参与最终实验研究的大鼠分别为：对照组（n=10），PD组（n=10），LID组（n=14）。

2.2 三组大鼠Thr389、S6Ser240/244表达及mTOR的蛋白活性比较 LID组大鼠Thr389、S6Ser240/244表达及代表mTOR蛋白活性p70S6K表达均明显高于PD组及对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；PD组大鼠Thr389、S6Ser240/244表达及代表mTOR蛋白活性p70S6K表达均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 三组AMPA受体亚基GluR1、GluR2阳性细胞数比较 三组均出现GluR1、GluR2表达，高倍视野（×200）下，LID组GluR1、GluR2阳性细胞数均明显高于PD组及对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；PD组GluR1、GluR2阳性细胞数均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

研究发现LID大鼠纹状体经4E-BP 1和p70S6K两个效应分子途径而激活mTOR通路，mTOR经磷酸化S6K的Thr389位点激活S6K，S6K激活后磷酸化Ser240/244和Ser235/236位点，致使Ser240/244

和Ser235/236位點表达上升[6-8]。另外mTOR还可通过磷酸化4E-BP 1的Ser65位点，激活4E-BP 1，释放eIF4E（真核细胞翻译启始因子4E），发挥调节mRNA的起始翻译，实现调节兴奋性突触可塑性介导的主要受体，如NR1、NR2和NR3表达。NR2又有NR2A和NR2B等不同亚型，NR1是功能亚单位，NR2和NR3是调节亚单位，它们不同的组合形成不同的四聚体，其功能与活性亦不同，但均不同程度上影响了神经元突触的兴奋性[9]。因而检测Ser240/244、Thr389的磷酸化表达水平差异可反应S6K通路的激活程度，辅助判断引发LID可能机制。p70S6K及4E-BP 1是细胞转录过程的关键调节分子，是mTOR下游的直接靶分子，mTOR特异性磷酸化位于p70S6K的389位点的苏氨酸，检测p70S6K水平可特异性反应mTOR蛋白分子活性[10]。

本研究发现LID组大鼠Thr389、S6Ser240/244表达及代表mTOR蛋白活性p70S6K表达均明显高于PD组及对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；PD组大鼠Thr389、S6Ser240/244表达及代表mTOR蛋白活性p70S6K表达均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。说明左旋多巴诱发异动症中mTOR信号显著激活，其可能是经由激活Thr389位点而激活S6K，间接激活S6Ser240/244位点，引发帕金森病及左旋多巴诱发异动症[11-13]。临床许多病理进程是由一种或多种突出后神经递质受体的故障互相关联，有研究发现纹状体神经元破坏S6K及Thr通路的相互作用可降低药物诱导下的LID及PD的进展及严重程度[14]。突触蛋白的功能主要为特异性转运，S6K及Thr通路的激活可改变突触可塑性的可能，进而诱导突触结构或突触单元异化，这可能是左旋多巴诱发异动症的直接机理。即mTOR磷酸化而活化，Thr389被激活，进而激活S6K，引发S6Ser240/244激活，后大量释放eIF4E，突触神经元可塑性被提升，引发突出元异化或结构失衡，导致PD发生及进展为LID。

AMPA是一种闭合速度快、对中枢神经系统突触信号传递具有显著作用的受体。神经系统突触后膜的AMPA受体亚基GluR1、GluR2随着信号的刺激发生数量级状态的变化，从而导致功能的变化[13，15]。有研究表示，长时程增强作用（long-term potentiation，LTP）模型中皮质纹状体突触内NMDA受体NR2A亚单位和AMPA受体GluR2、GluR3亚单位含量明显增加，而且对AMPA受体增加拮抗剂后，模型中LID的发生明显减弱[16-19]。从本文研究可知，受mTOR信号通路的激活，三组AMPA受体亚基GluR1、GluR2均有表达，但是LID组均明显高于其他两组，PD组也明显高于对照组，这表示，随着mTOR信号通路的激活，信号传入大鼠中枢神经突触后膜，引起AMPA受体亚基GluR1、GluR2数量增加，功能增强，可见AMPA受体功能增强在LID产生中起重要作用。

综上所述，本研究通过大鼠动物模型实验探讨mTOR信号通路在LID中的作用及可能机制，结果显示，PD及LID大鼠mTOR经磷酸化而活化，引发S6Ser240/244激活，导致突触神经元异常。而且PD及LID大鼠mTOR激活后，其AMPA受体亚基的GluR1、GluR2功能增强，均提示mTOR信号的激活参与了LID的发生，因此可能成为研究药物治疗LID的新靶标。

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（收稿日期：2018-05-14） （本文编辑：李莹莹）