低盐白鲢鱼糜凝胶超高压制备工艺优化及凝胶特性

戴慧敏叶 韬林 琳姜绍通陆剑锋

(1. 合肥工业大学食品科学与工程学院，安徽 合肥 230009；2. 淮南师范学院生物工程学院，安徽 淮南 232038)

白鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)营养丰富，是中国产量最高的大型淡水鱼种之一。但白鲢鱼肉薄刺多，土霉味、鱼腥味重，对其进行深加工，制作成冷冻鱼糜制品，可以提高产品附加值[1]。在鱼糜制品加工过程中，通常在斩拌工序中添加2～3 g/100 g·鱼糜的食盐(NaCl)来溶解肌原纤维蛋白，诱导蛋白质的展开，便于后续加热工艺能够形成热凝胶[2-3]；然而由于过量摄入食盐可能会引起高血压、骨质疏松、胃消化系统紊乱等多种疾病，因此开发低盐产品是鱼糜制品研发的一个重要方向。但是低盐条件下鱼糜蛋白质斩拌时不能够充分溶解展开，而导致低盐鱼糜凝胶强度低、持水性差、口感粗糙[4]6。因此提高低盐鱼糜凝胶的凝胶强度和持水性亟需解决。

凝胶强度、持水性是衡量鱼糜制品特性的重要指标，但目前的热加工方式(如传统水浴加热，又称“二段式加热”)对于改善鱼糜凝胶特性还不够理想[5]，尤其在改善低盐鱼糜凝胶特性方面。因此有研究将微波技术应用到低盐鱼糜中，如付湘晋等[6]发现采用微波加热的方法可以显著提高低盐白鲢鱼糜(1%)凝胶强度和持水性，然而微波加热选择性高，鱼糜内部升温不均匀，影响凝胶品质[7]。超高压作为一种新型技术，通过诱导鱼糜蛋白变性，破坏原有空间结构，构造新的凝胶网络结构，可以得到凝胶特性更好的鱼糜制品[8]。Cando等[9]的研究表明，超高压(300 MPa)应用低盐阿拉斯加鳕鱼鱼糜凝胶可以诱导肌原纤维蛋白展开，使得理化性质和感官特性优于普通食盐添加量(3%)鱼糜凝胶。同时，超高压对鱼糜凝胶特性的影响与压力、保压时间、温度、鱼糜种类等有密切关系，程珍珠等[10]研究发现400 MPa处理30 min时，马鲛鱼糜的硬度和咀嚼度分别提高了2.87和2.70倍；500 MPa处理30 min时，两者均有所下降。目前已有研究[11-12]采用超高压技术改善低盐海水鱼糜制品品质，但是在低盐淡水鱼糜制品中的应用较少，尤其是应用超高压技术制备低盐白鲢鱼糜还尚未见报道。

在前期制备低盐鱼糜的预试验中，得出添加1.5% NaCl可以保证白鲢鱼糜制品所属的咸味味感，但凝胶品质明显低于工业化生产中的白鲢鱼糜(含NaCl量为2.5%左右)。因此，本试验通过响应面法优化出超高压制备低盐鱼糜凝胶工艺参数，并对其凝胶特性进行分析，以期为改善低盐鱼糜凝胶品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活白鲢鱼：重量(1.0±0.2) kg，体长(36.0±3.0) cm，市售；

塑料肠衣：食品级，规格为45～47 mm(折叠直径)灌肠后直径约30 mm，市售；

氯化钠：食品级，市售；

乙醇、25% 戊二醛、溴化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水乙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)：分析纯，美丰生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

斩拌机：S2-5型，广州旭众食品机械有限公司；

超高压：HPP. L2-600/0.6型，天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司；

质构仪：TA-XT plus型，英国Stable Micro System公司；

台式高速冷冻离心机：CT15RT型，上海天美生化仪器工程有限公司；

电泳仪：DYY-11型，北京市六一仪器厂；

扫描电子显微镜：JSM-6490LV型，日本电子株式会社。

1.3 白鲢鱼糜凝胶的制备方法

1.3.1 鱼糜凝胶的制备

白鲢鱼糜解冻(4 ℃条件下)→斩拌(空斩3 min，添加1.5% NaCl或2.5% NaCl斩8 min)→灌肠→加热(二段式加热，先35 ℃加热1 h，再90 ℃加热0.5 h)→冷却(冰水冷却)→4 ℃条件下放置过夜→得到常压低盐鱼糜和常压普通鱼糜

1.3.2 低盐鱼糜的超高压处理 将灌肠之后的低盐鱼糜真空包装后，放入超高压设备，设置好已定的参数，进行升压、保压、卸压，之后取出样品，再进行二段式加热处理，得到高压低盐鱼糜凝胶。

1.4 超高压低盐鱼糜的单因素试验

鱼糜凝胶中添加1.5% NaCl，压力分别为100，200，300，400，500 MPa，保压时间为10 min，根据凝胶强度和持水性确定压力；鱼糜凝胶中添加1.5% NaCl，压力为300 MPa，保压时间分别为5，10，15，20，25 min，根据凝胶强度和持水性确定保压时间；鱼糜凝胶中添加1.5% NaCl，压力为300 MPa，保压时间为10 min，温度分别为10，20，30，40，50 ℃，根据凝胶强度和持水性确定温度。

1.5 超高压低盐鱼糜的响应面优化

从单因素试验中选取压力、保压时间以及温度的最佳范围，并以凝胶强度和持水性为响应值进行响应面优化。

1.6 鱼糜凝胶强度的测定

参照文献[13]。

1.7 持水性测定

参照文献[14]。

1.8 鱼糜凝胶品质的比较

从质构(TPA)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶以及微观结构等方面，将响应面优化后的超高压低盐鱼糜(1.5% NaCl)与常压低盐对照组(1.5% NaCl)和常压普通添加盐量对照组(2.5% NaCl)凝胶品质进行比较，分析超高压低盐鱼糜的品质特性。

1.8.1 TPA的测定 将鱼肠切成圆柱体(直径20 mm，高10 mm)。选用质构仪的 TPA(Texture Profile Analysis)模型分析低盐白鲢鱼糜凝胶的质构。测定参数设定为：探头类型为P/36R，触发类型Button、测试前速率1.00 mm/s、探头返回速率1.00 mm/s、下压距离4.00 mm，2次压缩之间的停留时间为5 s，重复检测6次。

1.8.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 称取鱼糜凝胶3 g，根据Kudre等[15]的方法进行电泳分析。

1.8.3 扫描电镜(SEM)观察凝胶结构变化 参照文献[4]16。

1.9 数据处理

所有数据均采用Excel 2003软件和SSPS 19.0进行作图和显著性统计分析。

2 结果与分析

2.1 超高压制备低盐鱼糜的单因素试验

2.1.1 压力对低盐白鲢鱼糜凝胶强度和持水性的影响 鱼糜凝胶强度是指凝胶破坏时单位面积所受的力，被作为评价鱼糜凝胶的坚实程度的指标[16]，凝胶强度大小可反映鱼糜凝胶性能好坏。由图1(a)可知，鱼糜凝胶强度随着压力增大，呈先增加后减少趋势，并在300 MPa达到最大值(P<0.05)。超高压处理使低盐白鲢鱼糜凝胶强度增大，可能是超高压处理促使蛋白质变性，使蛋白质网络结构更加致密，凝胶性能得到改善[17]。罗小玲等[18]研究表明高压对马鲛鱼凝胶性能在400 MPa达到最大，此后随着压力增加会破坏凝胶空间网络结构致使凝胶强度下降，降低鱼糜凝胶品质。

鱼糜凝胶持水性能力是指鱼糜在离心过程中将水分保持在其微观结构中的能力，是鱼糜凝胶特性的重要指标之一[19]。从图1(b)可以看出，压力在200～500 MPa时持水性在较好状态，有先增大后减少的趋势，说明超高压处理可以提高低盐鱼糜凝胶的持水性(P<0.05)，且在300 MPa达到最大值，与400 MPa没有显著性变化，可能是超高压处理促使蛋白质发生解聚，溶解性升高，使更多自由水与蛋白质形成结合水，增强持水性[20]。

不同字母表示差异显著(P<0.05)图1 压力对低盐白鲢鱼糜凝胶强度和持水性的影响Figure 1 Effect of pressure on the gel strength and WHC of low-salt silver carp surimi gels

2.1.2 保压时间对低盐白鲢鱼糜凝胶强度和持水性的影响

从图2(a)可以看出，保压时间对低盐白鲢鱼糜凝胶强度的影响也是呈先增大后减少的趋势，在保压10 min(300 MPa)时得到凝胶强度最大(P<0.05)；疏水键相互作用和二硫键之间的相互作用可以改善鱼糜凝胶强度[21]，保压10 min后，继续延长保压时间，鱼糜凝胶强度变化不明显(P>0.05)，而在保压时间达到20 min时的凝胶强度开始显著降低(P<0.05)。在胡飞华[22]32的研究中也得出类似结果，加压时间过长可能导致蛋白子分子内部化学键断裂，组织蛋白酶水解鱼糜中的大量蛋白质，且占主导作用，使得凝胶网络结构交联度降低，鱼糜凝胶强度下降[23]，因此加压时间过长不能改善鱼糜凝胶性能。

从图2(b)可以看出，保压时间对持水性的影响也是呈先增大然后减少的趋势，最大值在10 min(300 MPa)时得到(P<0.05)，但与保压时间15，20 min时均没有显著性差异，在保压时间为25 min时，鱼糜凝胶的持水性能显著降低(P<0.05)，可能是保压时间过长破坏蛋白质分子内部化学键，鱼糜凝胶网络交联度降低，致使水分流出，降低持水性。

不同字母表示差异显著(P<0.05)图2 保压时间对低盐白鲢鱼糜凝胶强度和持水性的影响

图2 Effect of holding time on the gel strength and WHC of low-salt silver carp surimi gels

2.1.3 超高压处理温度对低盐白鲢鱼糜凝胶强度和持水性的影响 从图3(a)可看出，超高压处理温度对低盐白鲢鱼糜凝胶强度影响显著。超高压处理温度升高不利于凝胶强度改善，随着温度升高，凝胶强度呈下降趋势，从30 ℃开始出现显著下降(P<0.05)，可能是低温度的超高压处理使得蛋白容易形成凝胶，鱼糜凝胶劣化温度带在40～50 ℃，内源性组织蛋白酶类能引起肌球蛋白分解，蛋白质凝胶网络结构容易被破坏，而导致凝胶特性急剧下降[22]33。因此超高压处理温度并不是越高越好，适宜的超高压处理温度可以得到较好的凝胶强度。

不同字母表示差异显著(P<0.05)图3 温度对低盐白鲢鱼糜凝胶强度和持水性的影响

图3 Effect of temperature on the gel strength and WHC of low-salt silver carp surimi gels

同样超高压处理温度过高也不利于鱼糜凝胶的持水能力。从图3(b)可以看出，随着温度升高，低盐白鲢鱼糜凝胶的持水性呈现减弱的趋势，30 ℃以后持水性显著下降，温度越高下降越快，可能是适宜的温度使蛋白质凝胶网络更致密，能捕捉住更多的水分，从而使持水性增大[24]，但是温度过高会导致蛋白质凝胶网络结构容易被破坏，水分流失以至于持水性能变差。

2.2 响应面优化超高压对低盐白鲢鱼糜最佳工艺的确定

2.2.1 回归模型的建立 在单因素试验结果的基础上，以凝胶强度和持水性为指标，采用三因素三水平进行Box-Benhnken试验设计和分析，试验因素水平见表1，试验设计及结果见表2。

2.2.2 凝胶强度回归模型的显著性检验和方差分析 采用Design-Expert 7.0软件对试验结果回归拟合，得到凝胶强度对压力、保压时间、处理温度的二次多元回归方程为：

表1 Box-Benhnken试验因素水平表Table 1 Factor and levels of Box-Benhnken

表2 试验设计及结果Table 2 Design and results of experiment

R1=254.03+8.91A+6.54B+11.35C+8.02AB-1.02AC-5.78BC-51.56A2-22.26B2-10.84C2。

(2)

凝胶强度的显著性检验和方差分析见表3，可以看出试验模型极显著(P<0.01)，失拟不显著(P>0.05)，表明该回归模型可用。回归模型的决定系数R2为0.990 4、变异系数C.V.为2.28%<10%，分别表明此二次多项式的回归效果好且回归模型具有试验稳定性。从表3还可以看出，一次项A、B、C，交互项AB、BC以及二次项A2、B2、C2对低盐鱼糜凝胶强度都有显著性影响(P<0.05)。

各因素的交互作用对低盐鱼糜凝胶强度的影响见图4。由图4可知，压力、保压时间和处理温度两两交互作用对鱼糜凝胶强度影响比较明显。当其他因素恒定，在一定范围内，随着超高压压力的提高和保压时间的延长以及处理温度的增大，鱼糜凝胶强度都呈现不同变化。其中，由于压力和温度二者曲线弯曲程度较大，可知压力和温度对凝胶强度影响较大，保压时间影响较小。

表3 凝胶强度的显著性检验和方差分析†Table 3 Significance and analysis of variance (ANOVA) of gel strength

† *差异显著，P<0.05；**差异极显著，P<0.01；R2为0.990 4；C.V.为2.28%。

2.2.3 持水性回归模型的显著性检验和方差分析 采用Design-Expert 7.0软件对试验结果回归拟合，可以得到持水性对压力、保压时间、处理温度的二次多元回归方程为：

R2=72.52+0.15A+0.88B+0.61C-1.16AB-0.025AC-0.033BC-1.5A2-2.32B2-0.21C2。

(3)

持水性的显著性检验和方差分析见表4，由表4可以看出试验模型极显著(P<0.01)，失拟不显著(P>0.05)。回归模型的决定系数R2=0.974 5，变异系数C.V.=0.61%<10%，可以得出此二次多项式的回归效果好且该回归模型具备试验稳定性。从表4还可以看出，一次项B、C交互项，AB以及二次项A2、B2对低盐白鲢鱼糜持水性都有显著性影响(P<0.05)。

图4 压力、保压时间和温度的交互作用对低盐鱼糜凝胶强度的影响Figure 4 Effects of pressure, holding time and temperature interaction on gel strength of low-salt surimi gels表4 持水性的显著性检验和方差分析†

方差来源自由度平方和均方F值P值显著性模型949.225.4729.74<0.000 1**A10.180.180.980.355 4B16.146.1433.410.000 7**C13.013.0116.390.004 9**AB15.385.3829.270.001 0**AC12.50E-032.50E-03 0.014 0.910 4BC14.23E-034.23E-030.0230.883 8A219.489.4851.58 0.000 2**B2122.6322.63123.07<0.000 1**C210.180.180.990.352 2残差71.290.18失拟30.280.0940.370.777 8纯误差41.010.25总和1650.51

† *差异显著，P<0.05；**差异极显著，P<0.01；R2为0.974 5；C.V.为0.61%。

图5所示是各因素的交互作用对低盐鱼糜凝胶持水性的影响。由图5可知，压力、保压时间和处理温度及交互作用对低盐白鲢鱼糜凝胶持水性影响比较明显。当其他因素恒定，在一定范围内，随着超高压压力的提高和保压时间以及温度的增加，鱼糜凝胶持水性有一定变化，且由于压力和保压时间二者曲线弯曲程度较大，可知压力和保压时间对持水性影响较大，温度影响较小。

2.2.4 最佳工艺的确定 通过Design-Expert软件计算分析得到最大凝胶强度和持水性时的最佳工艺条件是：压力306.22 MPa，保压时间10.64 min，温度26.95 ℃，由此预测出凝胶强度最大值为257.01 g·cm，持水性最大值为72.92%。考虑到实际操作和实验可行性，以压力300 MPa，保压时间10 min，温度25 ℃为条件进行验证性实验，此时凝胶强度为258.24 g·cm，持水性为71.92%。

2.3 超高压低盐鱼糜凝胶品质比较

2.3.1 凝胶特性的分析 由表5可知，优化后的超高压低盐鱼糜凝胶强度(258.24 g·cm)与最佳工艺理论值接近。几种鱼糜凝胶品质比较发现，在常压下(0.1 MPa)，添加1.5% NaCl的低盐鱼糜凝胶的凝胶强度、持水性均显著低于添加2.5% NaCl的普通鱼糜的(P<0.05)，因此，食盐添加量是影响白鲢鱼糜凝胶强度的重要因素。但经过超高压处理的低盐鱼糜凝胶的凝胶强度、持水性均显著(P<0.05)大于常压处理组的(2.5% NaCl和1.5% NaCl)，可能是高压可促进蛋白质分子内部交联，从而改善鱼糜凝胶网络结构，增强凝胶强度、持水性能，进而改善鱼糜凝胶特性[13]。TPA质构参数指标方面，在常压下(0.1 MPa)，添加1.5% NaCl的低盐鱼糜凝胶的黏附性、咀嚼度同样均显著低于添加2.5% NaCl的常压鱼糜的(P<0.05)；而超高压处理的低盐鱼糜凝胶的硬度、咀嚼度显著(P<0.05)下降，内聚性、回复性显著增加(P<0.05)，可能是超高压处理能增强蛋白质非共价键强度，致使鱼糜凝胶结构更紧凑，从而形成内聚性更好的凝胶网络结构[25]。超高压处理能够明显改善低盐鱼糜的质构特性，可作为降低白鲢鱼糜食盐添加量的一种有效手段。

图5 压力、保压时间和温度的交互作用对低盐鱼糜凝胶持水性的影响Figure 5 Effects of pressure, holding time and temperature interaction on WHC of low-salt surimi gels表5 凝胶特性结果验证†

样品硬度/g黏附性/(g·s)咀嚼度内聚性回复性凝胶强度 /(g·cm)持水性/%1.5% NaCl2 326.91±208.20a-73.77±1.22c1 738.51±99.23a0.78±0.07b0.41±0.12b203.92±9.93c67.83±1.50c2.5% NaCl2 286.02±132.10b-53.38±3.24b1 633.98±77.30b0.80±0.10b0.42±0.02b214.87±8.21b69.34±2.60bUHP+1.5% NaCl1 988.02±210.90c-38.49±2.11a1 266.17±53.44c0.85±0.03a0.46±0.06a258.24±1.00a71.92±0.27a

† UHP：300 MPa/10 min；同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 肌球蛋白重链(MHC，200 kDa)和肌动蛋白(Actin，43 kDa)是鱼糜蛋白中的主要成分，其中MHC是肌球蛋白分子中参与凝胶网络结构形成的最主要部分。由图6可知，几种鱼糜的肌球蛋白重链(MHC，200 kDa)有较大变化，而肌动蛋白条带无明显差异；添加2.5% NaCl的普通鱼糜凝胶MHC条带与添加1.5% NaCl的低盐鱼糜凝胶MHC条带的强度没有明显变化，但相比较而言，添加1.5% NaCl的低盐鱼糜凝胶MHC条带强度略强；而超高压处理的低盐鱼糜凝胶的MHC条带强度明显减弱。Cando等[26]研究表明，超高压鱼糜凝胶的MHC条带强度明显低于对照组凝胶，本研究结果与其类似。这可能是肌原纤维蛋白聚集成大分子，无法通过聚丙烯凝胶的微孔，导致其停留在浓缩胶上，使得电泳条带变弱[27]。图6中高压组的MHC条带强度明显减弱，可见超高压组的蛋白质聚合程度高于未处理组，超高压处理使更多的蛋白质分子通过非二硫共价键促进分子内及分子间的交联形成，从而影响着最终凝胶的品质[28]。因此，高压能诱导鱼糜中肌球蛋白发生变性，从而改善低盐鱼糜的凝胶特性。

a. 2.5% NaCl b. 1.5% NaCl c. 300 MPa/10 min，添加1.5% NaCl

M. 标准蛋白

图6 鱼糜凝胶SDS-PAGE图

图6 SDS-PAGE pattern of surimi gels

2.3.3 微观结构观察 图7为鱼糜凝胶扫描电镜图，由图7可知，超高压处理后的低盐鱼糜凝胶网络结构与添加1.5%，2.5% NaCl的鱼糜凝胶网络结构明显不同。与添加2.5% NaCl的鱼糜凝胶网络结构相比，添加1.5% NaCl的鱼糜凝胶表面相对不平整，孔隙大，凝胶结构松散不均匀。而超高压(300 MPa/10 min)的低盐鱼糜凝胶表面比较均匀平整，结构致密，孔洞数量明显减少。超高压处理可以增强凝胶基质密度和消除一些孔洞，形成光滑、连续、均匀的凝胶。超高压形成的致密凝胶网络结构与更高的持水性和破断力有关，从而形成良好的凝胶[29]，这也验证了前文中凝胶强度和持水性的相关结果。这可能是超高压能够诱导白鲢鱼糜蛋白质发生有利于聚合形成立体凝胶网络结构的均匀变性[25]，具有更高的持水性和凝胶强度，从而改善鱼糜凝胶特性。因此，超高压能够在一定程度上改善低盐鱼糜凝胶的微观结构。

图7 鱼糜凝胶扫描电镜图Figure 7 Micrographs of surimi gels (×10 000 times)

3 结论

超高压制备低盐白鲢鱼糜凝胶的最佳工艺条件为：压力306.22 MPa，保压时间10.64 min，温度26.95 ℃，此时鱼糜凝胶强度为258.24 g·cm，持水性为71.92%。超高压处理的低盐鱼糜内聚性、回复性显著高于常压低盐对照组(1.5% NaCl，0.1 MPa)和常压普通鱼糜对照组(2.5% NaCl，0.1 MPa)(P<0.05)；SDS-PAGE蛋白电泳和凝胶微观扫描结果表明，超高压处理的低盐鱼糜的肌球蛋白重链条带强度明显变弱，且形成了一个密集的、细致均匀的三维网络结构，明显优于2个常压对照组。因此，超高压技术可以提高低盐白鲢鱼糜的凝胶品质。然而，有关超高压提高低盐白鲢鱼糜凝胶品质的机制还有待进一步研究。