二仙汤含药血清通过AKT途径介导顺铂所致卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制＊

杨 蕾，王燕霞，赵丕文，孙丽萍，饶晨晨，杨 阳，张红红，陶仕英＊＊

（1.北京中医药大学东方医院 北京 100078；2.北京中医药大学中医学院 北京 100029；3.北京中医药大学东直门医院 北京 100050；4.北京中医药大学生命科学院北京 100029；5.顺义中医医院 北京 101300）

卵巢颗粒细胞（Ovarian granulosa cell，OG）是位于卵泡表面的多层壁细胞，颗粒细胞一方面能够参与运输营养物质供给卵母细胞，另一方面可以与卵泡内膜细胞共同作用，分泌激素、生长因子等多种物质，调控卵母细胞的发育。卵巢功能下降会导致卵泡数目减少、卵子质量下降[1]。卵巢储备功能发生异常直接影响女性的生育能力，可引发不孕[2]。

顺铂（Cisplatin,CDDP）是目前临床广泛应用于的化疗药物，作为细胞毒性药物杀死肿瘤细胞。顺铂在杀伤肿瘤细胞的同时，可以破坏正常的卵巢颗粒细胞，产生严重的细胞毒性作用[3]。由顺铂引起的卵巢功能破坏已经成为临床常见且难治愈性妇科疾病，且发病率在近几年呈现出上升趋势[4]。西医治疗主要是以雌、孕激素周期序贯疗法为主，改善相关症状。传统医学则认为卵巢功能发生异常主要是肾气亏虚，精血不足所致，治当以填精益髓，调理阴阳，补益天癸[5]。二仙汤是张伯讷教授研制出来治疗为绝经期综合症的方子，主要具有温肾益精、调理冲任、滋阴降火、平调阴阳的作用[6]。在临床治疗卵巢功能异常中具有明显的疗效。

近年来，随着研究的不断深入，本课题组前期也做了相关的实验研究。本课题组前期通过动物实验发现二仙汤具有调整生殖/内分泌，保护卵巢的作用[7]。但是对其作用途径和机理缺乏深入分析和探讨。因此，本实验将探讨二仙汤含药血清通过AKT途径介导顺铂所致卵巢颗粒细胞凋亡的保护机制，以期为临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 实验用药

二仙汤方剂组成包括：仙灵脾、巴戟天、当归、黄柏、仙茅、知母。按照《妇科临床方剂学》规定的剂量比（9∶6∶10∶15∶12∶10）称取，由北京中医药大学东直门医院提供，根据东直门院提供的中药颗粒与中药饮片的固有比例进行计算，最终按照人用药剂量计算大鼠用药剂量[7]为7.5*kg-1*d-1。注射用顺铂，每10 mg/支（齐鲁制药有限公司，批号：611048CF）、戊酸雌二醇片1 mg/片（拜耳医药有限公司，批号：195A5），均购自东直门医院。用法与剂量：成人每日1 mg，折算成大鼠所需剂量即0.009 mg·kg-1。

1.2 主要试剂

DMEM-F12培养基、0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone公司产品，批号1300510、1403413）、孕马血清促性腺激素（北京欧北有限公司，批号：hor-272）；特级胎牛血清（杭州四季青公司，批号：20160627）；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA细胞裂解液、30%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液、浓缩胶缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，批号：20160627、20160321、s1051、s1053），ECL超敏发光液（北京普利莱基因有限公司，批号：P1010），蛋白相对分子质量Marker（美国Thermo公司，批号：00246538）；二抗Anti-RabbitIgG/HRP和Anti-MouseI-gG/HRP（北京普利莱基因技术有限公司，批号：c1306c1340）；反转录试剂盒：M-MLV First Strand RT Kit、PCR酶：qPCR Master Mix（北京华英生物科技有限公司，目录号：RT03、Catalog：DBI-2043）；P-AKT、AKT抗体（美国Santa Cruz公司，批号：sc30066sc20341），引物序列（表1）。

1.3 实验动物

22-24 d健康雌性，SPF级，SD大鼠，共40只，体质量（60±10）g。购自（北京）斯贝福实验动物科技有限公司，使用许可证：SCXK（京）2011-0004。

1.3 仪器

CO2培养箱（MCO-20AIC,SANYO）；

倒置显微镜（TS100,NIKON）；

低温离心机（3K15,SIGMA）；

表1 引物序列

多功能荧光酶标仪（SAFIRE2,TECAN）；

超净工作台（022-2522，此京亚泰隆实验技术中心）；

鼓风干燥箱（101FXB-2，上海树立仪器仪表有限公司）；

压力蒸汽消毒器（YX-280d,江阴滨江医疗设备有限公司）；

离心机（北京京立离心机有限公司LG16-WA型）；

PCR扩增仪（Long Gene公司MyGene MG96+型）；

2 方法

2.1 原代大鼠卵巢颗粒细胞提取及培养

22-24天雌性SD大鼠10只，体重35 g，饲养在23-25℃，光照12 h，食水随意，适应性喂养一天，注射孕马血清促性腺激素50IU/只，48小时后，在无菌条件下取出双侧卵巢颗粒细胞进行培养。具体操作如下：

1）取SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后，经脱臼处死，浸泡75%酒精中消毒3分钟；2）消毒后放入已消毒托盘中在超净台中取双侧卵巢，放入预冷的Hank′s液2.7 ml；3）用Hank′s液清洗三次，将其中的脂肪、包膜等清理干净；4）将卵巢移入无血清培养基中，用1 ml一次性注射器刺破卵巢，5 min/只，使颗粒细胞充分释放；5）加入0.3 ml 2.5%胰酶反复用吸管吹打悬液数次，使颗粒细胞团块分离。37%消化10 min（每3 min，震荡或吹打一次）；6）加入1 ml含血清培养液终止消化，并静置10 min。取悬液加入15 ml离心管中；7）1 000 rpm离心10 min，弃上清。加入生理盐水5 ml冲散细胞再次离心；8）弃上清，加入10%胎牛血清0.2 ml，吹打均匀；9）计数：应用血球小板计数，调整悬液浓度，以5*105接种于96孔板中。在37℃，5%CO2培养箱中培养。观察贴壁情况，待细胞长满瓶底至75%-80%融合时，用于实验。

2.2 制备药理血清

22-24天的雌性SD大鼠50只，体重35 g-40 g，饲养在23-25℃，光照12 h，食水随意，适应性喂养一天，第二天取药理血清。具体操作如下：

表2 反转录反应条件

药理血清动物分三组：（1）正常组：灌胃蒸馏水0.4 ml/天（2）阳性对照组：灌胃补佳乐0.5 ml/天（3）二仙汤组：灌胃二仙汤0.4 ml/天，各组连续灌胃三天，于第四天晨起七点灌胃，两个小时以后，心脏取血并分离血清，-20℃保存。

2.3 顺铂干预卵巢颗粒细胞

待细胞生长至底壁的75%-80%时，将模型组、阳性对照组、二仙汤组的培养基吸出，每孔加入CDDP（浓度为2.5 ug/ml）200 ul，放入37℃，5%CO2的培养箱中培养12 h。

2.4 药理血清处理

于CDDP作用12 h后，进行给药处理，每孔加入相应的药理血清组200 ul，放入37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h，进行指标测定。

2.5 TUNEL法检测大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡情况

1）收集细胞，胰酶消化然后离心，去上清液，留沉淀；2）加入4%多聚甲醛固定放在4℃冰箱保存2 d；玻片加入稀释好的TdT和DIG-d-UTP，混匀；4）吸走切片上多余液体后将所有样品统一放入湿盒中，37℃、2 h、0.01M TBS洗2 min，清洗3次；5）每片滴加封闭液50 µl，放置室温下30 min，然后甩掉封闭液；6）用抗体稀释液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体：混匀后滴加50 µl；7）将样品放置于湿盒中，37℃反应30 min。0.01 M TBS洗2 min，清洗3次；8）用抗体稀释液1：100稀释SABC：取1 ml抗体稀释液加SABC 10µl，混匀后分别滴加50µl至每个标本切片上；9）37℃反应30 min；10）0.01 M TBS洗5 min，清洗4次；11）加SABC-FITC的标本在荧光显微镜下调用蓝色光激发并观察、记录；

2.6 蛋白印迹法（Western Blot）检测各组颗粒细胞中akt、p-akt蛋白表达量

1）蛋白提取；2）蛋白质定量；3）SDS－PAGE电泳：配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。SDS-PAGE电泳（浓缩胶80 V，分离胶120 V），电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜；4）电转膜仪转膜：采用湿转法进行电转移，60 V，120 min；5）封闭：室温下在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中于摇床上轻轻摇动封闭1.5 h；6）一抗孵育：加一抗4℃过夜，用TBST在室温下摇床上洗三次，每次10 min。7）二抗孵育：加二抗室温孵育1 h，用TBST在室温下摇床上洗三次，每次10 min。8）蛋白检测：显色加HRP-ECL超敏发光剂作用2-5 min，置于保鲜膜内固定于暗盒中、。9）图像的采集与分析将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

2.7 RT-PCR检测各组卵巢颗粒细胞中akt基因表达量

2.7.1 提取各实验组大鼠卵巢颗粒细胞的RNA

1）将细胞全部收集，去掉上清后，加入400 ul RNA Lysis Buffer，并重悬细胞；

2）向上一步混合液中加入等体积的无水乙醇，并混匀；

3）将上述混合液过IIC柱；并12 000 rpm离心1 min；弃废液；

4）向 IIC 中 加入 400 ul RNA Wash Buffer，并12 000 rpm离心1 min；

5）向IIC中加入40 ul预先配制的DnaseI Reaction Mix（5 ul DnaseI+40 ul DNA Digestion Buffer），室温放置15 min，然后离心；

6）加 400 ulRNA Prep Buffer，并 12 000 rpm 离心1 min；

7）加700 ulRNA Wash Buffer，并12 000 rpm离心1 min；

8）加400 ulRNA Wash Buffer，并12 000 rpm离心3 min；

9）加入25 ul Dnase/Rnase-Free Water洗脱RNA。

2.7.2 RNA浓度测定

提取好的RNA，浓度测定结果如下：OD值符合要求。

2.7.3 反转录

反应条件：42℃，60 min；70℃,10 min（表2）。

2.7.4 荧光定量PCR

待测基因和内参基因每个样品各做三个重复，并设阴性对照；

反应体系（表3）及条件：

2.7.5 RT-PCR结果统计

所测目的基因与内参基因对比后，用实时荧光定量PCR的相对定量法2-ΔΔCT计算，代表AKT RNA的表达情况。ΔΔCT法计算的相对表达量的公式如下：

ΔCT=CT目的基因-CT内参基因

ΔΔCT=ΔCT检验组-ΔCT对照组

相对表达量=2-ΔΔCT

3 结果

3.1 二仙汤含药血清对卵巢颗粒细胞凋亡形态学观察

与正常组相比，模型组凋亡十分明显。与模型组相比，阳性对照组凋亡得到缓解，二仙汤组与模型组相比较凋亡情况也得到改善（图1）；由此可看出二仙汤含药血清能抑制顺铂干预后的卵巢颗粒细胞损伤。

表3 反应体系

3.2 TUNEL法观察二仙汤含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡形态学影响

与正常组相比，模型组凋亡情况十分明显。与模型组相比，阳性对照组凋亡情况得到缓解，二仙汤组与模型组相比较凋亡情况也得到改善（图2）；由此可看出二仙汤含药血清能抑制顺铂干预后的卵巢颗粒细胞损伤。

3.3 蛋白印迹法检测各组大鼠卵巢颗粒细胞akt、p-akt蛋白表达量的变化

图1 观察各组卵巢颗粒细胞情况

图2 TUNEL法观察各组卵巢颗粒细胞凋亡情况

图3 .1各组卵巢颗粒细胞akt蛋白的表达量的变化

图3 .2各组卵巢颗粒细胞P-akt蛋白的表达量的变化

表4 各组卵巢细胞中akt、p-akt蛋白表达量分析结果（x±s，n=6）

图4 各组卵巢颗粒细胞P-akt蛋白的表达量的变化

图5 各组卵巢颗粒细胞akt蛋白的表达量的变化

图6 各组卵巢颗粒细胞akt蛋白的表达量的变化

和正常组比较，akt、p-akt蛋白表达量总体趋势走向、强度、结果相似。使用顺铂造模后的各实验组中的akt、p-akt蛋白表达量均减少，模型组akt、p-akt蛋白表达量最少，P＜0.05有统计学意义；和模型组比较，各治疗组均akt、p-akt蛋白表达量表达增多，但akt、p-akt蛋白表达量均低于正常组，其中二仙汤组akt、p-akt蛋白表达量略低于阳性对照组akt、p-akt蛋白表达量，P＜0.05有统计学意义（表4）。

表5 各组卵巢细胞中akt基因表达量分析结果（x±s，n=6）

3.4 RT-PCR检测各组大鼠卵巢颗粒细胞akt基因表达量的变化

和正常组比较，使用顺铂造模后的各实验组中的akt基因表达量均减少，模型组akt基因表达量最少，P＜0.05有统计学意义；和模型组比较，各治疗组akt基因表达量表达增多，但akt基因表达量均低于正常组，其中二仙汤组akt基因表达量略低于阳性对照组akt基因表达量，P＜0.05有统计学意义（表5）

图7 AKT基因扩增曲线

图8 AKT基因溶解曲线

4 讨论

本课题组前期实验已经探索到二仙汤能够升高大鼠血清中激素水平，降低由顺铂所致的细胞凋亡[8]；明确二仙汤能够提高各组大鼠卵巢颗粒细胞中bcl-2蛋白的表达，降低各组大鼠卵巢颗粒细胞中bax蛋白的表达；考虑二仙汤可能通过改善激素水平，抑制卵巢储蓄功能破坏，通过调控凋亡调控蛋白，最终起到改善卵巢功能的作用[9]。为了进一步了解二仙汤经pI3k/akt信号通路在临床治疗中的作用机制，本实验通过选取22-24 d大鼠原代培养颗粒细胞并用顺铂造模的方法建立大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的模型，经补佳乐及二仙汤含药血清干预。运用分子生物学方法研究各实验组AKT的表达及变化。探讨二仙汤含药血清通过AKT途径介导顺铂所致卵巢颗粒细胞凋亡的保护机制。

本次实验采用TUNEL检测技术观察各组卵巢颗粒细胞凋亡情况。结果显示：与正常组相比，模型组凋亡率明显增加。与模型组相比，阳性对照组凋亡情况及二仙汤组凋亡情况均有改善。提示二仙汤可以有效地降低顺铂损伤后的卵巢颗粒细胞的凋亡。蛋白印迹法检测各实验组akt、p-akt蛋白表达量。结果显示：和正常组比较，顺铂造模后的各实验组中的akt、p-akt蛋白表达量均减少，模型组akt、p-akt蛋白表达量最少，P＜0.05有统计学意义；和模型组比较，各治疗组均akt、p-akt蛋白表达量表达增多，但akt、p-akt蛋白表达量均低于正常组，其中二仙汤组akt、p-akt蛋白表达量略低于阳性对照组，P＜0.05有统计学意义。提示二仙汤含药血清可以抑制顺铂损伤的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况，考虑可能是因为二仙汤可能通过AKT途径提高akt、p-akt的表达，影响下游靶蛋白，最终起到保护卵巢的作用。RT-PCR检测检测各实验组akt基因表达水平与蛋白印迹表达相一致。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是与细胞调亡和细胞増殖关系非常密切的信号传导通路之一，其主要作用有（1）诱导缺氧诱导因子1的表达和活性；（2）是细胞内重要的信号转导途径，与多个蛋白或激酶参与细胞生理功能的调节；（3）参与细胞生长、存活、增殖、调亡、血管生成、自噬等过程中，发挥着极其重要的生物学功能[10]。AKT又称PKB，是PI3K下游一种主要的效应蛋白，其在PI3K/AKT/mTOR这一个信号通路中处于中心环节。在正常的生理状态下，活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，从而调节细胞的功能。在PI3K/AKT/mTOR信号通路的异常激活过程中，AKT通过直接磷酸化下游靶蛋白mTOR，而活化后的mTOR进一步磷酸化激活其下游的靶分子，从而促进细胞周期的进展[11]。AKT被磷酸化之后可通过进一步诱导Bax/Bcl-2、Caspase3/8/9和FOX家族磷酸化，并抑制它们的活化，通过这样来起到抑制细胞调亡的作用；AKT可进一步促进肿瘤坏死因子以及环氧化酶-2诱导的血管生成和内皮细胞迁移[12]。

二仙汤可以有效地降低经顺铂损伤后的大鼠卵巢颗粒细胞的细胞凋亡，保护颗粒细胞，能够减缓卵巢储备功能下降，起到很好的治疗效果。考虑可能是因为二仙汤通过AKT途径提高akt、p-akt的表达，影响下游靶蛋白，通过调节PI3K/AKT信号通路而达到保护卵巢的作用。