王老吉凉茶中试提取过程的近红外在线检测研究＊

2018-10-10马晋芳王雪利史庆龙蒋华壮葛发欢

世界科学技术-中医药现代化 2018年5期

马晋芳，肖雪，王雪利，彭银，史庆龙，蒋华壮，葛发欢＊＊

（1.中山大学药学院广州 510006；2.中山大学南沙研究院广州 511458；3.广东药科大学广州 510006；4.广东省中药超临界流体萃取工程技术研究中心广州 510006）

凉茶是我国人民在长期预防疾病与保健的过程中，以中医养生理论为指导，以多种中草药为基础，研制总结出的一类具有清热解毒、生津止渴等功效的饮料总称[1-2]。

王老吉凉茶是著名的广东凉茶之一，主要由金银花、菊花、仙草、夏枯草、鸡蛋花、布渣叶、甘草共七味药材经过现代工艺制造而成的一种用于清凉祛火，清热解毒的现代凉茶产品[2]。凉茶中含有多种成分，其有效成分可能为总酚酸类成分[3]。咖啡酸是一种天然的酚类化合物，具有抗氧化、抗辐射等多种功能活性[4]。目前，对王老吉凉茶质量研究较少，有报道采用液质联用法分析王老吉凉茶中的成分[5]。在王老吉凉茶的实际生产过程中，如果采用液质联用法或高效液相色谱法进行含量测定，分析结果存在滞后性，难以满足在线分析的要求[6]。

随着科学技术的进步，目前近红外在线光谱仪已实现技术成熟化、产业化，它能提供成分含量、物理化学性质等多个内在质量参数的在线测量，从而为基于中药内在成分含量的质量控制模式提供了技术支持。以近红外在线光谱仪为核心设备，实现中药生产过程在线检测，并根据检测结果实现生产过程的智能化控制将是中药生产过程的大势所趋，将成为中药现代化生产的核心技术[7-9]。为了进一步提高王老吉凉茶药材利用率、降低生产成本，因此，引入近红外光谱技术，对凉茶生产工艺过程中的提取阶段中总酚酸和咖啡酸的含量进行研究。本研究采用近红外光谱在线分析技术，结合偏最小二乘法，对王老吉凉茶中试提取过程进行实时在线检测研究，为王老吉产品质量检测提供有效支持。

1 材料和方法

1.1 仪器和药材

图1 王老吉凉茶提取过程在线近红外原始光谱

UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）；XS205 DuaLRange型十万分之一分析天平（梅特勒-托利多）；UV-2600紫外分光光度计（岛津（中国）有限公司）；Matrix-F近红外光谱仪（德国布鲁克公司）；化学计量学分析系统（THUNIR V3.0（Demo），清华大学），在线监测分析系统（THU NIR Online（Demo），清华大学）；中小型提取罐（30L）。乙腈（色谱级，德国默克），甲酸、碳酸钠（分析级，广州化学试剂厂）。福林酚溶液（天津市光复精细化工研究所）；咖啡酸标准品（110885-200102，中国食品药品检定研究院）；没食子酸标准品（批号：110831-201605，中国食品药品检定研究院）；王老吉凉茶混合药材（广州王老吉药业股份有限公司提供）。

1.2 样品制备

提取罐中加入纯化水200 L，开启搅拌，用蒸汽将水加热到煮沸，将已称好的10 kg混合药材投入提取罐中，在温度90±2℃提取90 min，提取过程中进行近红外控制时每隔约2 min采样一次，按样品采集时间编号，并置于密封容器中存放。

1.3 在线近红外采集光谱[10-11]

光谱采集条件：选用2 mm光程，以空气为背景，采用透射模式在线采集提取液吸收光谱，光谱范围为800-2 500 nm，扫描次数32次，分辨率2 nm，每个提取液样品重复扫描3次，得出平均的光谱数据，采集的近红外原始光谱见图1。

1.4 王老吉凉茶提取液中指标成分的含量测定

1.4.1 王老吉凉茶中总酚酸的含量测定[12]

1.4.1.1 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸标准品，加水配制成0.645 mg·mL-1的对照品溶液。

1.4.1.2 供试品溶液的制备

取“1.2”项下样品各5 mL，再加入5 mL蒸馏水，混匀即可。

1.4.1.3 测定方法

分别精密量取标准品溶液与供试品溶液1 mL，加入1.8 mL福林酚试剂,室温反应5 min后加入1.2 mL 7.5%碳酸钠溶液，避光放置1.5 h后于765 nm下，以水为空白测定其吸光度。

1.4.2 王老吉凉茶中咖啡酸的含量测定[13-14]

1.4.2.1 色谱条件

色谱柱 phenomenex Luna 5u C18(2)100A（250×4.6 mm）；流动相体系：乙腈-0.3%乙酸水溶液；流动相A为乙腈，流动相B为0.3%乙酸水溶液，梯度洗脱（0-20 min，7%-20%A；20-30 min，20%-95%A），流速为0.8 mL/min，柱温35℃，检测波长：316 nm。检测器：紫外检测器DAD-3000，进样量：20 μL。

1.4.2.2 对照品溶液的制备

精密称取咖啡酸标准品，加甲醇配制成浓度为0.214 mg·mL-1的咖啡酸母液。精密量取母液0.8 mL至5 mL容量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液。

1.4.2.3 供试品溶液的制备

取“1.2”项下样品各5 mL，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液。

1.4.2.4 测定方法

分别精密量取标准品溶液与供试品溶液各20 μL，经HPLC测定。

1.5 样本的在线监测分析

采用THU NIR Online（Demo）对王老吉凉茶提取过程中的各个批次进行分析比较，对光谱进行波长选择，排除噪声干扰，反应检测目标成分的变化情况，选择提取过程趋势一致的批次进行模型的建立与预测分析。

1.6 数据处理

将符合生产条件的样本划分为校正集、验证集及外部预测集，采用多种光谱预处理方法如无预处理、卷积平滑、一阶卷积求导、二阶卷积求导、归一化法、多元散射校正、标准正态变量变换中的一种或几种对光谱进行优化[15-18]。采用多种波长选择方法，如全波长法、相关系数法、相关成分法、迭代优化法等对光谱进行波长选择[10,11,17]，采用偏最小二乘法对样本的光谱数据与其性质的含量值做回归拟合计算，建立校正模型。

1.7 模型评价参数[19-20]

采用交互验证标准偏差（SECV）、校正标准偏差（SEC）、主因子数（LV）、决定系数（R2）作为指标，评价模型的性能。

2 结果与分析

2.1 提取液中总酚酸测定结果

根据测定方法中建立的UV-Vis法，对提取液中的总酚酸进行含量测定，方法学主要参考中药药典和已报道过的文献[12]，其精密度、重复性、稳定性的RSD值分别为0.82%、2.34%和0.25%，均小于3.0%，平均加样回收率为97.64%，均符合分析要求，所建立的线性方程为Y=1.4356X+0.0246，R=0.9995，各批次的提取液中总酚酸的测定结果见表1、表3、表5。

2.2 提取液中咖啡酸测定结果

根据测定方法中建立的液相方法，对提取液中的咖啡酸进行含量测定，方法学主要参考中药药典和已报道过的文献[13-14]，其精密度、重复性、稳定性的RSD值分别为0.97%，0.83%和2.97%，均小于3.0%，平均加样回收率为98.57%，均符合分析要求，所建立的线性方程为Y=78.9692X+0.0302，R=1.0000，各批次的提取液中咖啡酸的测定结果见表2、表4、表6。

2.3 各批次样本的在线监测分析

采用THU NIR Online（Demo）对王老吉凉茶提取过程中的六个批次进行分析比较[21]，光谱波长选择为834-1830 nm，检测目标成分的变化情况，如图2所示为第一批次趋势变化图，从左向右，趋势逐渐趋于平衡，提示达到提取完全。通过比较各个批次，选择提取过程趋势一致的五个批次进行模型的建立与预测分析。

2.4 样本集的划分

根据2.3中样本的在线监测分析结果，选出5批符合现场生产条件的样本进行建模和验证分析，其中包括118个建模样本，30个外部验证样本，1个批次34个在线验证样本。

2.5 近红外模型的建立

2.5.1 光谱预处理

采用“1.6”中的光谱预处理方法，对所“1.3”中采集的建模原始光谱进行光谱预处理来消除基线漂移，提高信噪比，提取关键信息。本研究比较了几种常用预处理方法，提高了模型的稳定性和预测的准确性，结果见表7，交叉验证相关系数R越接近1，内部交叉验证均方差SECV越小，预处理方法越好。最终确定对总酚酸和咖啡酸分别进行卷积平滑预处理，在其所有预处理方法中SECV最小，分别为0.0620和0.0010。

2.5.2 波长的选择方法

本研究中对总酚酸和咖啡酸的建模波段进行优选，结合各成分中分子结构的差异性，通过比较全波长、相关系数法、迭代优化波长选择方法，优选最佳建模波段，并建立数学模型，确定近红外光谱与含量的关系。结果显示迭代优化波长选择方法能最大程度地利用光谱中的有效信息，并消除噪音等因素的影响，因此，对全波长法、相关系数法、迭代优化波长选择方法进行比较（表8）。结果显示迭代优化波长选择方法的相关系数最高，SECV值最小，所以，总酚酸和咖啡酸均选择迭代优化波长选择方法建立定量模型。

2.5.3 模型维数的确定

本研究中采用偏最小二乘法建立定量模型，维数的选择对模型的预测能力有较大影响。在校正集样本一定的情况下，维数过多，则会由于噪音偏大而出现过拟合现象；维数过少则会由于包括的信息不完全导致模型的预测能力差。因此，本研究选择两个指标成分的模型维数分别为4和6，结果见图3。

2.5.4 模型的建立

在线提取液的近红外光谱分别经卷积求导预处理后，采用迭代优化波长选择方法，运用偏最小二乘法分别建立定量校正模型并分析，结果显示总酚酸和咖啡酸的相关系数分别为0.9759和0.9664，内部交叉验证均方差SECV分别为0.0620和0.0010，具体模型的参数见下表。

2.6 模型的外部验证与在线验证

选取30个样本作为外部验证集，34个样本作为在线验证集，预测总酚酸和咖啡酸的含量，并与高效液相法测定值进行比较，验证校正模型的准确性，预测值与真实值的拟合结果见图4，相关系数均大于0.85，说明预测值和真实值相对吻合，可见总酚酸和咖啡酸的定量校正模型具有良好的预测能力。

3 讨论

通过建立的近红外光谱校正模型，获得的王老吉凉茶提取液中总酚酸和绿原酸近红外预测值与HPLC测定值基本一致，且预测值的变化趋势也与在线提取过程的含量相符合。结果证实了近红外光谱在线技术在王老吉凉茶的中试提取过程中应用的可行性，为下一步在王老吉凉茶的大生产过程中实施近红外在线动态质量监控提供了研究基础。

此外，本实验采用同一批次的药材作为研究对象，整体预测效果较好，但仍存在有个别异常光谱，分析原因，不排除提取过程中循环设备仪器引起的遮光现象。这也提醒在后续研究工作特别是在线过程分析中要充分考虑各种干扰因素。