推拿联合跑台训练对大鼠坐骨神经吻合术后雪旺细胞及相关神经因子影响的研究

王春红，严隽陶，马书杰，陆永嘉，陶然，马颖，史智君，孔亚敏

1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437；2.上海中医药大学康复医学院，上海 201315

周围神经损伤是临床上棘手的难题，尽管显微外科可以将神经外膜精密吻合，但手术之后的功能恢复并不理想[1～2]，推拿联合主动运动是临床常用的术后康复锻炼方法[3～4]，但其疗效及作用机制并未明确，本实验旨在探索推拿联合跑台训练对大鼠神经吻合术后神经再生的作用机理，以期为临床治疗方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠80只，体质量180～200 g，生产许可证号：SCXK(沪)2015-0008，用于建立坐骨神经即时缝合模型。

1.2 主要仪器及试剂 采用YLS-15A大鼠轮转式跑步机；按摩仪(与复旦大学合作研制出的1台摸拟人手捏法的仪器)；电子天平(上海天平仪器厂)；显微镜(OLYMPUS公司CX41)；水合氯醛(奥鑫助剂厂C0073)。

1.3 造模及分组 80只大鼠分别以10%水合氯醛30 mg/kg做腹腔注射麻醉，无菌条件下行臀部切口，于臀肌间显露右侧坐骨神经，距梨状肌下缘1 cm处切断坐骨神经，立即在外科显微镜下用11/0缝合线行外膜缝合，关闭伤口，其中40只于术后3周后行推拿手法治疗为治疗组，另40只为模型组。

1.4 干预方法 ①推拿手法(捏法)：采用与复旦大学合作研制出的1台摸拟人手捏法的按摩仪器，按摩头为1环形充气气囊，由按摩仪主机控制其参数，气囊绑缚在大鼠患侧小腿，对腓肠肌进行按摩。手法刺激参数为6 kpa，刺激2 min，休息1 min，再刺激2 min，每次总共5 min。手法干预每天1次。②跑台训练：采用YLS-15A大鼠轮转式跑步机，转速为5转/min，每转0.65 m，持续5 min。每天训练1次，均在手法干预结束后进行。

1.5 检测指标 各组大鼠治疗后1、2、3、4个月分别选取10只麻醉后，采用RM-6240BD四通道生理记录仪，采集频率100 kHz，扫描速度0.8 ms/格，灵敏度4 mV，时间常数0.2 s；频波频率100 Hz，刺激电压1 V，波宽0.1 ms。将刺激电极置于坐骨结节下方神经两侧，两对记录电极分别置于腘窝处和跟腱处神经两侧，底线位于刺激电极和腘窝处记录电极之间。神经传导速度为两对记录电极的距离与动作电位出现的时间差的比值。随后，切取神经样本包埋并固定，免疫组化染色后，采集分析样本相关部位，计算阳性细胞数。进行统计分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS21.0软件进行数据分析与处理，计量资料以(±s)表示，采用2×4析因设计A因素：不同干预手法(治疗组和模型组)；B因素：1个月、2个月、3个月和4个月(1M、2M、3M和4M)4个干预时长。所有统计检验以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经传导速度变化结果比较 见表1、图1。与模型组比较，治疗组在相同干预时长1M、2M、3M、4M时大鼠的神经传导速度均较高，差异均有统计学意义(P＜0.01)。与1M比较，治疗组和模型组4M时大鼠的神经传导速度均较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 各组大鼠神经生长因子 (Nerve growth factor，NG F)变化结果比较 见表2、图2。与模型组比较，治疗组在干预时长为1M、2M、3M、4M时大鼠的NGF较高，差异均有统计学意义(P＜0.01)。与1M比较，模型组4M时大鼠的NGF较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；治疗组3M、4M时大鼠的NGF均较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠雪旺细胞变化结果比较 见表3、图3。与模型组比较，治疗组在1M、2M、3M、4M时大鼠的雪旺细胞差异无统计学意义(P＞0.05)。与1M比较，治疗组和模型组大鼠的雪旺细胞在3M、4M时均较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠神经传导速度变化结果比较(±s) m/s

表1 各组大鼠神经传导速度变化结果比较(±s) m/s

与模型组比较，①P＜0.01；与同组1M比较，②P＜0.05

组 别模型组治疗组n 40401M 15.68±5.9432.20±4.15①2M 13.60±2.3631.96±7.82①3M 19.96±1.1026.14±5.19①4M 46.17±17.97②57.15±20.78①②

图1 各组大鼠神经传导速度数值变化结果比较

表2 各组N G F变化结果比较(±s)

表2 各组N G F变化结果比较(±s)

与模型组比较，①P＜0.01；与同组1M比较，②P＜0.05

组 别模型组治疗组n 40401M 591.00±81.51639.90±75.69①2M 672.12±29.11681.00±29.59①3M 662.90±114.93868.60±102.53①②4M 736.40±114.93②829.25±143.66①②

图2 各组大鼠N G F数值变化结果

表3 各组大鼠雪旺细胞变化结果比较(±s) 个

表3 各组大鼠雪旺细胞变化结果比较(±s) 个

与模型组比较，①P＞0.05；与同组1M比较，②P＜0.05

组 别模型组治疗组n 40401M 48.00±21.5437.60±16.07①2M 55.75±18.2852.25±14.53①3M 77.70±20.38②89.80±19.58①②4M 82.80±24.96②98.66±21.73①②

图3 各组大鼠雪旺细胞变化结果比较

3 讨论

神经传导速度受神经电缆特性的影响，即膜电容和内阻愈高，传导速度越慢。坐骨神经损伤后，远端基底膜管内充满坏死的髓鞘和神经纤维组织，内阻增高增大，神经传导速度减慢[5]。神经传导速度是神经冲动传导速度的直接表现，传导速度的快慢能在一定程度上反映出神经纤维的再生情况[6]，本实验干预时长为1M、2M、3M时治疗组的神经传导速度均明显高于模型组，说明推拿联合跑台训练可以明显提升神经传导速度，促进神经再生。

NGF是一类能介导神经元生存和诱导神经突生长的化学物质，主要来源于雪旺细胞和感觉神经分布密集的组织。其在神经细胞的发育、损伤修复过程中均起到重要作用，正常状态可保持神经细胞的存活、生长、分化，损伤状态可诱导神经细胞的再生。正常情况下，成年人坐骨神经中NGF水平很低。一旦神经受到损伤后，NGF水平迅速上升[7]，推拿手法联合跑台训练在1M、2M时未能明显提高NGF的表达，但在治疗至3M时NGF的表达明显高于模型组，提示推拿手法联合跑台训练促进了NGF的表达与分泌，为神经轴突再生提供适宜的微环境。4M时两组间无明显差异，可能是在损伤神经修复成功后，神经轴突重新与组织建立支配关系，损伤部位的雪旺细胞回到静止状态[8]，不再继续表达NGF所致。

雪旺细胞在周围神经损伤后的再生中起重要作用，它可以清除变性崩解物，表达促进轴突生长的多种营养因子，对轴突起黏附趋化作用等，在神经断裂后24 h，雪旺细胞开始分裂、增殖、清除变性碎屑，变性产生的髓鞘降解物等可以促进变性初期雪旺细胞的迁移和增殖[9]。本实验发现2组间雪旺细胞无明显差异，可能是神经损伤后迅速增殖的雪旺细胞，一方面与巨噬细胞共同吞噬解体的轴突和髓鞘，一方面在基膜管内排列成细胞索，形成Bungner带。大量实验证明，Bungner带-基底膜结构是神经再生理想的微环境[10]。这一结构在神经损伤2、3周后便形成。本实验治疗时间最短为1个月，并且造模成功后修养21天才开始治疗。靠近断口处的雪旺细胞形成细胞桥把两端连接起来，随后近端神经纤维轴突末端长出轴突支芽越过雪旺细胞桥进入基膜管内[11]，随着神经的修复，雪旺细胞已迁移至远离损伤口的一端，而实验取材统一在损伤口附近，因此组间未见明显差异。但电生理检测可发现推拿手法联合跑台训练仍可提高神经传导速度，通过检测NGF的含量可发现推拿手法联合跑台训练能够促进NGF的表达与分泌，然而NGF主要来源于雪旺细胞，因此可以推测推拿手法促进了雪旺细胞的增殖、分裂以及迁移。

周围神经损伤后的再生机制十分复杂，包括神经轴突再生的微环境、瓦勒变性的程度、神经元的存活数量等，推拿联合跑台训练促进神经修复的机制研究仍任重道远，本研究团队在今后的研究中将注重神经的整体性，从神经轴突不同层面研究推拿与肢体功能锻炼对神经再生的作用，而脊髓层面的研究将是今后研究的重要内容。