微小RNA-142-5p对人前列腺癌细胞LNCaP增殖和侵袭的影响

王斌 张志敏 王东 金丰 毛万里 朱文彦 王阁

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，随着我国人口老龄化，前列腺癌的发病率呈现逐年上升趋势[1-2]。对于侵袭性及复发性的前列腺癌，目前尚无有效治疗方法，寻找新的前列腺癌的药物治疗靶点一直是国内外学者研究的热点[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)属于内源性非编码小RNA，通过调控肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等细胞生物学行为，在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[4]。研究miRNA调控肿瘤细胞的分子机制可能为临床诊断和治疗肿瘤提供更好的策略。miR-142-5p在许多肿瘤研究中都有报道，如结直肠癌、非小细胞肺癌、肾癌等[5-7]，但在前列腺癌中的报道较少。本研究旨在观察miR-142-5p对前列腺癌细胞增殖与侵袭的影响，并通过生物信息学预测及双荧光素酶报告基因检测实验探究miR-142-5p的作用机制。

材料与方法

一、材料

人前列腺癌细胞系LNCaP购于上海信然生物技术有限公司；胎牛血清购于杭州四季青生物公司；DMEM培养液购于美国Hyclone公司；Lipofectamine®3000购于美国Invitrogen公司；miR-142-5p模拟物、对照序列miR-NC和PCR引物购于上海吉玛公司；实时定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒购于日本TaKaRa公司；细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天公司；噻唑蓝(MTT)试剂盒购于美国Sigma公司；Transwell小室购于美国Corning公司；双荧光素酶报告基因检测实验试剂盒购于美国Promega公司；野生型与突变型TOP2A荧光素酶报告基因质粒(pGL-4载体)由南京诺唯赞生物科技有限公司设计并合成；Matrigel基质胶和一抗TOP2A、Cyclin E1、CDK2、β-catenin、Vimentin和GAPDH购于美国BD公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国Abcam公司；超敏ECL发光试剂盒购于美国Thermo公司。

二、细胞培养和转染

采用DMEM培养液加10%胎牛血清于37 ℃、5% CO2条件下培养人前列腺癌细胞系LNCaP。转染前1 d，将处于对数生长期的LNCaP细胞接种于6孔板中，每孔接种3×105个，按照Lipofectamine®3000说明书进行转染。实验分为2组：对照组(转染miR-NC)和实验组(转染miR-142-5p模拟物)，8 h 后观察细胞状态并更换新鲜DMEM培养液。

三、qPCR检测转染后细胞中miR-142-5p和TOP2A的表达量

采用Trizol法提取细胞中总RNA，逆转录为cDNA。分别用miR-142-5p和TOP2A引物通过PCR仪扩增检测细胞中miR-142-5p和TOP2A的表达，以U6和GAPDH作参照。按照qPCR试剂盒说明书建立反应体系。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性5 s，65 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，反应35个循环。实验重复4次，结果用2-ΔΔCt值表示。miR-142-5p上游引物：5′-GGATCATAAAGTAGAAAGCA-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；TOP2A上游引物：5′-ACCATTGCAGCCTGTAAATGA-3′，下游引物5′-GGGCGGAGCAAAATATGTTCC-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

四、流式细胞术分析细胞周期

收集各组细胞，PBS溶液洗涤2次，加入70%乙醇4 ℃下固定过夜。PBS溶液洗涤2次，加入Rnase A和溴化丙啶染液，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

五、MTT法检测细胞增殖能力

收集各组细胞，按3 000个/孔接种于96孔板，共接种5块培养板，每孔加200 μl培养液。在每个测量点，每孔中分别加入15 μl 5 mg/ml的MTT试剂，37 ℃再培养4 h后吸去培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，摇床振荡溶解结晶，用酶标仪检测每孔在波长490 nm处的吸光度(A)值。分别检测培养第1、2、3、4、5天的细胞增殖能力。

六、Transwell实验检测细胞侵袭能力

用无血清DMEM培养液按5∶1稀释Matrigel基质胶，均匀铺于Transwell小室，37 ℃凝固4 h。将处于对数生长期的2组细胞消化后，用无血清DMEM培养液调整细胞密度为1.5×105个/ml，在Transwell小室内加入200 μl细胞悬液，在Transwell小室外加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养液。连续培养24 h后，棉签擦去上层细胞，甲醇室温固定20 min，结晶紫染色,室温染色20 min，清水冲洗、晾干。显微镜下每孔随机取4个视野计数，取平均数。

七、生物信息学预测和双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-142-5p的靶基因

结合生物信息学预测软件TargetScan、miRecords及miRWalk的分析，预测miR-142-5p的靶基因。将野生型TOP2A质粒命名为TOP2A 3′ UTR-WT，将突变型TOP2A质粒命名为TOP2A 3′ UTR-MUT。将处于对数生长期的LNCaP细胞接种至24孔板，待孔内细胞密度达60%，将miR-142-5p模拟物或miR-NC分别与TOP2A 3′ UTR-WT或TOP2A 3′ UTR-MUT质粒用Lipofectamine®3000共同转染至LNCaP细胞。转染48 h后，按照双荧光素酶报告基因检测实验试剂盒说明书检测各组细胞荧光活性，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值反映各组细胞的相对荧光素酶活性。

八、免疫印迹法(Western blot)检测靶基因的表达

收集细胞，加入蛋白裂解液裂解，提取总蛋白。加入等量蛋白样品，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转至PVDF膜。5%封闭液室温封闭2 h，4 ℃过夜孵育TOP2A、Cyclin E1、CDK2、β-catenin、Vimentin和GAPDH一抗(稀释比均为1∶1 000)。加入相应二抗，室温下孵育2 h。滴加超敏ECL发光试剂显色，凝胶成像仪拍照。

九、统计学方法

结 果

一、LNCaP细胞转染miR-142-5p的效率

qPCR检测结果显示(图1)，实验组和对照组细胞中miR-142-5p的表达量分别为(9.20±0.76)和(1.03±0.13)，实验组miR-142-5p的表达量是对照组的8.93倍，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 实验组和对照组LNCaP细胞中miR-142-5p的表达量(与对照组比较bP<0.01)

二、LNCaP细胞转染miR-142-5p对细胞周期的影响

流式细胞术检测发现(图2)，与对照组比较，实验组处于G0/G1期的细胞数量明显增加，而处于S期的细胞数量明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)，表明miR-142-5p一定程度上抑制前列腺癌细胞LNCaP从G0/G1期向S期转变。

图2 miR-142-5p对LNCaP细胞周期的影响(与对照组比较aP<0.01，bP<0.01)

三、LNCaP细胞转染miR-142-5p对细胞增殖的影响

MTT检测结果显示(图3)，实验组LNCaP细胞在转染后第4、5天的A值低于对照组，差异均有统计学意义(P=0.04，P=0.004)，表明miR-142-5p一定程度上抑制前列腺癌细胞LNCaP的增殖。在第1、2、3天的A值差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 实验组和对照组LNCaP细胞增殖能力比较(与对照组比较aP<0.05，bP<0.01)

四、LNCaP细胞转染miR-142-5p对细胞侵袭的影响

如图4所示，实验组和对照组细胞中穿膜细胞数分别为(72.83±10.76)和(158.30±19.71)个。与对照组比较，实验组穿膜细胞数明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，miR-142-5p一定程度上抑制前列腺癌细胞LNCaP的侵袭。

图4 实验组和对照组LNCaP细胞侵袭能力比较(与对照组相比bP<0.01)

五、生物信息学预测结果

结合生物信息学预测软件TargetScan、miRecords及miRWalk的分析，预测miR-142-5p的靶基因为TOP2A，具体的结合序列见图5。

图5 miR-142-5p与TOP2A 3′-UTR互补结合的序列

六、miR-142-5p与TOP2A的靶向结合验证

与TOP2A 3′ UTR-WT相比，TOP2A 3′ UTR-MUT由序列“ACUUUAU”突变为“UGAAAUA”。将miR-142-5p模拟物或miR-NC分别与TOP2A 3′ UTR-WT或TOP2A 3′ UTR-MUT质粒转染至LNCaP细胞中，采用双荧光素酶报告基因检测实验检测相对荧光素酶活性，以检验miR-142-5p与TOP2A的靶向结合。如图6所示，miR-142-5p可明显抑制TOP2A 3′ UTR-WT质粒转染细胞的相对荧光素酶活性，而对TOP2A 3′ UTR-MUT质粒转染细胞的相对荧光素酶活性无影响，表明miR-142-5p可靶向结合TOP2A基因。

七、LNCaP细胞转染miR-142-5p对TOP2AmRNA表达的影响

qPCR检测结果显示，转染后实验组LNCaP细胞中TOP2A mRNA的表达量(0.26±0.08)显著低于对照组(1.00±0.07)，差异有统计学意义(P<0.01)。

八、Western blot检测TOP2A蛋白的表达

为进一步探讨miR-142-5p在LNCaP细胞中的作用机制，采用Western blot检测转染miR-142-5p模拟物48 h后TOP2A蛋白、细胞周期相关蛋白、细胞侵袭性相关蛋白表达情况。结果显示，与对照组相比，实验组TOP2A表达水平降低，细胞周期相关蛋白如Cyclin E1、CDK2表达降低，细胞侵袭性相关蛋白β-catenin表达升高，Vimentin蛋白表达降低(图7)。

1：miR-142-5p+TOP2A 3′ UTR-MUT；2：miR-142-5p+TOP2A 3′ UTR-WT；3：miR-NC+TOP2A 3′ UTR-MUT；4：miR-NC+TOP2A 3′ UTR-WT

图6 双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-142-5p与TOP2A的靶向结合(与1相比bP<0.01)

图7 转染miR-142-5p模拟物对TOP2A蛋白及相关蛋白表达的影响

讨 论

研究前列腺癌增殖和侵袭的机制对前列腺癌患者的靶向药物治疗具有重要意义[8]。miRNA是一种长约19～25个核苷酸的小分子单链RNA，可与靶基因mRNA的3′非编码区配对结合，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译，在转录后水平干扰基因的表达[9-10]。目前，已有多种miRNA如miR-136、miR-181c、miR-204被证明与前列腺癌的形成相关[11-13]。越来越多的研究显示，miR-142-5p与多种肿瘤的发生有关[14-16]。Wang等[7]研究发现miR-142-5p在非小细胞肺癌组织和细胞系中表达显著下调，miR-142-5p过表达可在体内外显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。Lou等[15]发现miR-142-5p过表达通过抑制肝癌细胞的生长和诱导细胞凋亡，在肝癌中表现为重要的抑癌基因作用。Qin等[16]研究表明，在神经胶质瘤组织和细胞系中，miR-142-5p的表达显著下调，miR-142-5p的过表达可显著抑制神经胶质瘤的迁移和侵袭。以上结果表明miR-142-5p可能在恶性肿瘤中发挥抑癌作用，但miR-142-5p在前列腺癌中的报道较少。

我们利用脂质体瞬时转染法，在前列腺癌细胞LNCaP中过表达miR-142-5p，探讨miR-142-5p对前列腺癌细胞生物学行为的影响。结果表明过表达miR-142-5p的LNCaP细胞较对照组增殖和侵袭能力明显受到抑制，表明miR-142-5p可能在前列腺癌的发生、发展中发挥抑癌作用。流式细胞术结果表明miR-142-5p可阻滞LNCaP细胞G0/G1期向S期的转换，这可能是miR-142-5p抑制前列腺癌细胞增殖的主要原因。本研究首先通过生物信息学分析发现TOP2A是miR-142-5p的靶基因。TOP2A基因位于17q12染色体，在染色体结构的保持、染色体分离、DNA复制等生物学过程中起重要作用[17]。近年来的研究表明，TOP2A的基因表达与肿瘤的发生、发展密切相关，已发现在乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多种肿瘤中有高表达的倾向，与肿瘤的恶性生物学行为及患者的不良预后显著相关[17-19]。TOP2A在前列腺癌特别是侵袭性较高的前列腺癌中呈现高表达[19]。TOP2A可能成为前列腺癌患者的药物治疗靶点。双荧光素酶报告基因检测实验进一步验证了miR-142-5p可直接结合TOP2A 3′ UTR。本研究显示，当miR-142-5p过表达可下调TOP2A的蛋白水平。TOP2A蛋白下调后，细胞周期相关蛋白如Cyclin E1、CDK2表达降低，表明细胞周期受到显著阻滞。细胞侵袭性相关蛋白β-catenin表达升高，Vimentin蛋白表达降低，表明细胞侵袭性下降。miR-142-5p对前列腺癌细胞增殖和侵袭的调控可能是通过抑制TOP2A蛋白实现的。本研究的不足之处在于没有检测临床前列腺癌组织标本中miR-142-5p的表达量，我们下一步将通过收集临床前列腺癌组织标本和患者临床随访信息，探讨miR-142-5p与前列腺癌患者诊疗、预后的相关性。

总之，本研究结果表明，miR-142-5p与TOP2A存在靶向关系，miR-142-5p可通过靶向调控TOP2A，阻滞前列腺癌细胞LNCaP的细胞周期，抑制细胞的增殖与侵袭，说明miR-142-5p在前列腺癌中为抑癌基因，有望在前列腺癌的分子治疗中发挥特异性作用。