婴幼儿配方米粉克罗诺杆菌污染调查与分析

梁安莉，农珍妮，杨江夏，黄 彦

(1广西民族大学相思湖学院，南宁 530008；2青岛大学医学部，山东青岛 266071；3广西疾病预防控制中心，南宁 530028)

目前认为克罗诺杆菌属包括7个种：阪崎克罗杆菌、丙二酸盐克罗诺杆菌、尤尼沃思克罗诺杆菌、苏黎世克罗诺杆菌、莫金斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌和康帝蒙提克罗诺杆菌[1-6]。克罗诺杆菌属对环境耐受，不同种间具有不同的毒力特性[7]，是一种条件致病菌。临床病例和分子生物学鉴定发现，C.sakazakii具有更强致病力。6月龄以下的婴幼儿和60岁以上的成人易感，其临床症状主要为致命性的坏死性结肠炎、脑膜炎、败血症等。6月龄以下的早产儿感染该菌的死亡率高达40%～80%[8-10]。世界卫生组织和多个国家已将其列为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，要求在婴儿配方奶粉中不得检出[11-12]。我国高度重视克罗诺杆菌污染情况的监控，将其列入食源性致病菌的监测范围[7]。据报道，婴儿配方奶粉的克罗诺杆菌污染被认为是引起婴儿发病的主要原因[13-14]。此外，各种母乳替代用品也是克罗诺杆菌污染源之一[15-17]。目前，市售的婴幼儿米粉为了增加营养常加入一些营养添加成分，而蔬果、淮山、乳粉等原料均是克罗诺杆菌污染来源[18]，增加了感染的风险。为了了解目前市售婴幼儿配方米粉受克罗诺杆菌的污染情况，及不同添加营养成分与污染是否具有相关性，本研究对广西区市售不同配方的婴幼儿米粉受克罗诺杆菌种属污染的情况进行调查鉴定。

1 材料和方法

1.1 样品采集

在广西区内超市购买不同品牌、不同批次婴幼儿米粉共125份，其中纯营养米粉25份(未添加其他配料原料的)、添加淮山(淮莲)粉的46份、添加蔬果粉的20份、添加高蛋白乳粉的34份。

1.2 克罗诺菌分离培养

按照2007年Iversen的方法进行菌株的分离培养[19]，无菌称取100 g样品，充分溶于900 mL 缓冲蛋白胨水(北京路桥)的三角瓶中，置于37℃ 培养18 h，移取1mL的增菌培养物转种至10 mL 万古霉素改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(北京路桥)，44℃培养24 h后，在阪崎肠杆菌显色培养基(青岛海博)上划线转种，37℃培养24 h。挑取显色培养基中的蓝绿色菌疑似菌落进行下一步纯化鉴定。

1.3 克罗诺菌属鉴定

纯化后的疑似菌株用VITEK 2 compact 生化鉴定仪 (bioMèrieix，法国)进行克罗诺菌属鉴定，对照菌株阪崎克罗诺杆菌ATCC 25944 购自美国标准菌株库。

1.4 fusA基因测序

用DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)提取细菌基因组DNA。fusA基因扩增参照Baldwin方法进行[20]，引物fusA-F：5’-GAAACCGTATGGCGTCAG-3’和fusA-R：5’-AGAACCGAAGTGCAGACG-3’，PCR 用扩增试剂盒(Qiagen，US)，反应体系为 50 μL：10μL Q solution、4 μL模板 (5～10 ng/μL)、2 μL的fusA-F引物(10 μmol/L)、2 μL的fusA-R引物(10 μmol/L)、5 μL 10×PCR缓冲液 (含15 mmol /L MgCl2)、1 μL dNTP Mix 溶液 (每种10 mmol /L)、0.25 μL Taq聚合酶(5 U)和25.75 μL去离子水。扩增条件：95℃ 预变性 3 min、95℃ 变性 1 min、58℃ 退火 1 min、72℃ 延伸 2 min，循环 30 次；最后 72℃ 延伸 5 min。PCR 产物用 1% 琼脂糖电泳，电泳条件电泳条件为 1 × TAE 电泳缓冲液，电压40 V/cm，电泳 2 h，在紫外光下切胶回收，送生工生物(上海)有限公司双向测序。

1.5 细菌种类鉴定和进化树构建

获得的fusA基因序列在多位点序列分型(MLST)数据库中 http：//pubmlst.org/cronobacter/info/protocol.shtml 进行种类鉴定和等位基因序列的查找，并用Mega 7 最大似然算法构建进化树。

2 结果和分析

2.1 感染情况

经增菌培养、显色培养基分离、克罗诺菌属鉴定，20株米粉样品确定为克罗诺杆菌属，总污染率为16.00%，其中淮山(淮莲)营养配方米粉污染率最高，为26.09%，其他添加配方的营养米粉污染率均比未添加的营养米粉的高(附表)。

2.2 菌株鉴定和进化分析

通过fusA基因序列在MLST数据库中比对鉴定，20株阳性菌包含4个不同种克罗诺杆菌，其中C.sakazakii14株、C.malonaticus3株、C.dublinensis2株、C.muytjensii1株。构建的进化树以克氏柠檬酸杆菌为外群，发现这4种不同的克罗诺杆菌独立成群(附图)。本调查表明，在婴幼儿营养米粉中主要流行的为C.sakazakii，与国内外报道在植物性原材料、食品中致病能力较强的C.sakazakii是克罗诺杆菌属主要的污染源相一致[5.20-22]。

附表 不同配方米粉克罗诺杆菌感染情况

附图 米粉中分离的20株克罗诺杆菌的进化分析

3 讨论

本调查发现，广西区内DRP受克罗诺杆菌污染较为严重，且添加营养成分的婴幼儿米粉污染率比单纯的营养米粉要高：添加果蔬的配方米粉的污染率约为单纯的营养米粉的2倍，添加淮山、淮莲粉的配方米粉的污染率约为单纯的营养米粉的3倍。分析其主要原因为：(1)可能与添加的植物性营养成分本身是克罗诺杆菌的重要来源[23-28]有关。已有研究者通过实验证实了克罗诺杆菌能存在于25℃采摘的新鲜蔬果，并大量繁殖[10]。陈万义等[29]调查上海102份蔬菜中克罗诺杆菌菌株，确定13份样品污染，分离率高达13%(13/102)；此外，植物性原料的较高的污染率可能与种植过程、运输和加工环节有关。(2)可能与婴幼儿米粉的生产工艺有关。为了更好地保持添加原料中的营养成分，添加成分往往在添加前没有进行相应的灭菌处理，缺乏相应的添加原料安全合格检测指标，且目前企业在混合添加的过程中，主要采取预处理-混合添加-微波消毒的工艺方式，而克罗诺杆菌耐干燥、耐高温，形成生物膜后粘附能力强的特点，该加工工艺有灭菌不彻底的风险[28]。

为了降低克罗诺杆菌对DRP的污染风险，我们建议生产企业从原材料的质量监控、生产工艺、生产、运输设备、包装各个环节着手做好监控：(1)严把原材料关：对生产原料实行严格的质量监控，做好质量安全检测。(2)优化生产工艺：继续做好生产流程优化、监控外，上市前进行有效的抽检；(3)生产企业要制定和严格实施清洁、消毒管理制度，对生产设备和运输设备进行定期、有效的清洁和消毒；(4)严格执行国家的食品包装要求，在产品包装上，尤其应对冲调方法、喂养注意事项进行说明，建议用高温(70℃以上)水冲调米粉[16，冲调后尽快喂食。◇