实验用西藏小型猪CYP3A46基因扩增梯度PCR方法的建立

卢康荣　白静　张嘉宁　谢水林　顾为望　黄黎珍　王万山

【摘 要】目的：建立西藏小型猪CYP3A基因梯度PCR扩增方法。方法：以西藏小型猪肝脏总cDNA为模板，基于CYP3A46基因引物，对CYP3A46进行梯度PCR扩增（设计温度梯度55-65℃）。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得特异性好的最佳退火温度。结果：各退火温度均能特异的扩增出1500bp左右的目的条带。结论：本反应体系及各温度梯度均可特异性扩增西藏小型猪CYP3A46基因，为进一步克隆表达奠定了基础。

【关键词】细胞色素P450酶；西藏小型猪；克隆

中图分类号： Q78 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2018）19-0088-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.19.039

Establishment of gradient PCR amplification method for CYP3A46 gene of laboratory Tibet minipigs

LU Kang-rong1 BAI Jing2 ZHANG Jia-ning3 XIE Shui-lin2 GU Wei-wang3 HUANGLi-zhen2 WANG Wan-shan3*

（1.Basic Medical College of Southern Medical University， Guangzhou Guangdong 510515， China；2.School of Bioscience and Bioengineering， South China University of Technology， Guangzhou Guangdong 510006， China；3.Laboratory Animal Service Center， Southern Medical University， Guangzhou Guangdong 510515， China）

【Abstract】Objective： Establishing gradient PCR amplification method for CYP3A46 gene of Tibet minipigs. Methods： Based on CYP3A46 primers， using total cDNA of Tibet minipig liver as template， CYP3A46 was amplified by gradient PCR， temperature gradients were set as 55-65℃. PCR fragments was checked by DNA agarose gel electrophoresis， trying to get the best annealing temperature. Results： A specific band of 1500 bp corresponding to the target band could be amplified by any temperature from 55 to 65℃. Conclusions： CYP3A46 gene of Tibet minipigs could be specifically amplified by this reaction system and temperature gradients， laying a foundation for the further cloning and expression.

【Key words】Cytochrome P450 enzyme；Tibet minipig；Clone

由于與人在解剖、生理生化等方面有极大相似性，小型猪在人类疾病动物模型、器官移植、新药研发等领域的研究日益广泛，已成为除灵长类和犬以外唯一被FDA推荐的临床前大动物实验动物[1-2]。小型猪是人类药物代谢（尤其是CYP3A途径代谢类药物）的重要模型动物，但其细胞色素 P450 的研究大大落后于人及大鼠等实验动物。国外的研究主要集中在 Goettingen和Yucantan小型猪上，国内对小型猪细胞色素 P450 的研究仅在巴马小型猪和贵州小型猪有少量报道[3-4]。实验用西藏小型猪已在生物医药领域广泛应用，但是关于其P450酶系研究尚属空白[5]，本研究拟建立西藏小型猪CYP3A46基因梯度PCR扩增技术方法，为进一步的克隆表达研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

6月龄成年西藏小型猪肝脏组织置液氮中保存，Trizol总RNA抽提试剂（GIBCO）， PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit购于宝生物工程（大连）有限公司；DNA Marker购于天根公司；其它试剂为国产分析纯或常规生化试剂。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据Genebank中基因序列CYP3A46（NM_001134824），设计合成正向引物Scyp3a46-F：5'gtggc catgg acctg atccc3'；反向引物Scyp3a46-R：5'aagtc aggct ccact tgtgg3'。引物送英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2 西藏小型猪肝脏总cDNA的制备

TRIZOL 法提总RNA。使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，按说明书操作规程进行西藏小型猪肝脏总cDNA的制备。

1.2.3 西藏小型猪CYP3A46基因编码序列的梯度PCR扩增

应用梯度PCR进行反应条件的优化：反应体系如下：

反应程序：预变性98℃ 5min；98℃ 10s，52-62℃ 15s，72℃ 20s；30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。

1.2.4 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳及片段胶回收

将5μL DNA MarkerⅢ、PCR产物和5μL6×Loading Buffer全部置于1%琼脂糖凝胶，200V恒压电泳20min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外激发光下观察片段大小。

2 结果

选择引物CYP3AF和CYP3A46R，对CYP3A46进行梯度PCR扩增（设计温度梯度55-65℃），以期找出最佳扩增条件。结果见图1，表明各退火温度均能特异的扩增出1500bp左右的目的条带。

3 讨论

药物在猪体内的生物转化与人极为相似，是非临床安全性评价的良好模型。加之小型猪饲养成本低，操作简便，因此小型猪应用于新药开发研究已成为国际范围内的焦点。国外小型猪资源匮乏，我国小型猪品种资源丰富[6]。但是国外尤其是欧洲的G？觟ttingen小型猪已在世界范围内广泛应用，尤其是药理、毒理等新药研发领域[7]。我国小型猪资源开发水平与欧美发达国家比较仍有较大差距。西藏小型猪是从西藏引进，在广州地区进行风土驯化及实验动物化的小型猪猪种，该小型猪具备抗疾病能力强、应激反应小、术后愈合快等优点，是非常有特色的实验小型猪[8]。

I相药物代谢酶-细胞色素P450酶系（CYPs）在众多外来化合物（包括药物）的生物转化过程中扮演了重要角色， 据估计60%普通处方药需要通过细胞色素P450系统进行生物转化，催化的底物广泛，是人体内最主要的代谢酶，在药理学、毒理学研究中有着重要的意义[9]。有研究表明小型猪1A、2E、3A、4A等具体亚型可作为药物代谢模型。小型猪与人CYP3A的序列同源性较高，关于其亚族中的CYP3A29研究最多，该酶为人CYP3A4在猪体内的同源酶。目前国内外关于小型猪各亚型CYP酶的药物代谢特征报道甚少[10]。国内有报道贵州小型香猪肝微粒体CYP酶主要亚型的反应活性，与人肝微粒体的活性相近，并呈现出与人相应酶特异性抑制剂的抑制反应活性[11]。杨家大等报道巴马小型猪、贵州小型香猪肝脏CYP3A29 mRNA表达水平与人CYP3A4相近[12]。

鉴于关于西藏小型猪的CYP酶特性研究目前尚属空白，为了克隆西藏小型猪相关CYP基因进行深入研究，本实验基于梯度PCR技术，摸索PCR扩增西藏小型猪CYP3A46的最佳退火温度和反应条件。研究结果表明，55-65℃范围内的各退火温度均能特异的扩增出1500bp左右的目的条带，各温蒂条件下扩增效果类似，说明该反应体系和退火温度条件适于进行西藏小型猪CYP3A基因的克隆扩增，为后续研究奠定了基础。

【参考文献】

[1]Stricker-Krongrad A， Shoemake CR， Liu J， et al. The importance of minipigs in dermal safety assessment： an overview[J]. Cutan Ocul Toxicol. 2017；36（2）：105-113.

[2]Helke KL，Nelson KN，Sargeant AM，et al.Pigs in Toxicology：Breed Differences in Metabolism and Background Findings[J]. Toxicol Pathol.2016；44（4）：575-90.

[3]薛正楷，魏泓，商海濤，叶彬.CYP3A29稳定表达HepG2细胞株的建立及其硝苯地平代谢活性鉴定[J].中国人兽共患病学报，2009，25：640-644.

[4]Yao M，Dai M，Liu Z，et al. Comparison of the substrate kinetics of pig CYP3A29 with pig fiver microsomes and human CYP3A4[J].Biosci Rep 2011.31：211-220.

[5]Liu W， Wu LH， Yue M， et al.Generation of DKK1 transgenic Tibet minipigs by somatic cell nuclear transfer （SCNT） [J]. Oncotarget. 2017；8（43）：74331-74339.

[6]邹迪莎，于健.巴马小型猪动物模型在医学领域的研究进展[J].中国畜牧兽医，2017，4：1128-1134.

[7]Descotes J，Allais L， Ancian P， et al. Nonclinical evaluation of immunological safety in G？ttingen Minipigs： The CONFIRM initiative[J].Regul Toxicol Pharmacol， 2018，94：271-275.

[8]廖洁丹，林连蓬，梁楚瑶，杨权，罗怡，等.广东西藏小型猪血液生理生化指标的分析[J].黑龙江畜牧兽医， 2017，11：121-123.

[9]Millecam J， De Clerck L， Govaert E. et al. The Ontogeny of Cytochrome P450 Enzyme Activity and Protein Abundance in Conventional Pigs in Support of Preclinical Pediatric Drug Research[J]. Front Pharmacol. 2018： 14；9：470.

[10]蔡毅，卢康荣，陈妙良，等.实验用小型猪细胞色素P450酶研究进展[J].动物医学进展，2014：35（6）：123-126.

[11]Shang H， Guo K， Liu Y， et al. Constitutive expression of CYP3A mRNA in Bama miniature pig tissues[J].Gene.2013： 25；524（2）：261-7.

[12]杨家大，商海涛，魏泓，等.实时荧光定量检测中国实验用小型猪肝脏CYP3A29mRNA表达水平[J].遗传，2007：29（5）：575-580.