综合设计性实验在病理生理学教学中的实践与评价——观察限制性液体复苏对休克肠I/R损伤的保护作用

袁文丹，李小辰，张 颖，马 月，毛慧琳，杨程程

（滨州医学院，山东 烟台 264003）

学生综合设计性实验是对传统的实验进行的一项教学改革，是依托机能学开放实验室开设的综合设计性实验。本综合设计性实验的创新点是在原来病理生理学家兔休克实验的基础上设计的，观察限制性液体复苏对失血性休克肠缺血再灌注（I/R）的影响及治疗作用。本综合设计性实验训练了学生综合运用知识的能力，并探讨肠I/R复苏治疗的作用及预后，提高了学生发现问题、分析问题、解决问题的能力。

1 实验的思路和方法

1.1 学生自主设计实验方案

实验教师提前1~2周给出实验目的，讲解实验的有关要求，进行分组；学生通过上网查阅大量文献自行设计实验方案[1]，内容包括实验目的和原理、所需的动物和器材、主要的实验步骤和方法、预期的结果等。学生在课堂上对获得的知识加以概括、分析、综合，经小组内部讨论后参与班上的讨论，确定实验方案。如学生自主设计方案之一：“研究限制性液体复苏方式对失血性休克肠I/R的影响，并评价效果、估计预后。”该实验的创新点之一是：探讨不同液体复苏方式对肠I/R损伤的影响及可能导致多系统器官功能障碍（MODS）的机制。本实验创新点之二是：学生针对肠I/R损伤，科学合理地设计观察指标，如观察自由基脂质过氧化损伤产生的肠丙二醛（MDA）含量、血浆中MDA含量、碱剩余（BE）及内毒素（LPS）水平，为肠I/R损伤机制研究及预后提供了实验依据。

1.1.1 实验目的和原理 休克后肠黏膜I/R损伤是导致MODS的重要基础和中心环节，因此减少肠黏膜I/R损伤是减少全身炎症反应（SIRS）的发生及阻止休克转化为MODS的关键。本实验通过建立失血性休克动物模型，观察不同液体复苏状态下小肠黏膜I/R损伤程度，检测肠组织MDA含量、血浆中MDA含量、碱剩余及内毒素水平的变化，探讨复苏治疗作用及估计预后，为临床实践提供进一步的理论和实验依据。

1.1.2 实验方法和步骤 方法：家兔24只，随机分为假休克组、限制补液组、常规补液组、休克未治疗组，每组6只。假休克组动物仅穿刺颈动脉、颈静脉，给予插管但不放血。其他3组动物进行颈动、静脉插管，连接血压记录仪，然后从颈动脉放血，使血压降至40~50 mmHg，接着根据血压的变化放出或回输少量血液，使血压继续维持在40~50 mmHg之间，并且观察30分钟。在制作休克模型成功后，限制补液组、常规补液组分别经颈静脉输入林格氏液，血压分别维持在60~70 mmHg和90~120 mmHg；而休克未治疗组不输入任何液体。在治疗60分钟后，除假休克组外，均用乳酸林格氏液与抗凝的全血按2∶1的体积比进行充分复苏，并继续维持大鼠血压在休克前水平，持续60分钟。4组均于治疗开始的0分钟、60分钟、120分钟分别取肠系膜上静脉血1 ml，然后测定血浆MDA、BE、LPS含量，并于实验120分钟时处死动物，无菌操作下开腹，距回肠瓣5 cm处取回肠4 cm，生理盐水洗净，组织匀浆，测定肠组织MDA含量。另外，肠组织用10%甲醛固定，常规取材制片，HE以及PAS染色，光镜下观察病理变化。

1.2 学生独立完成实验

本实验方案在教师指导下，教师和学生一起对其科学性、创新性、可行性进行了讨论，实验由学生独立完成，既培养了严谨求实的学风，又培养了学生的动手能力和创新能力。

1.2.2 实验结果（部分结果如下）（1）失血性休克时，缺血再灌注损伤导致肠黏膜损伤加重，液体复苏后家兔血浆中及肠道组织匀浆中MDA水平升高，血BE负值增大，LPS含量增加，说明肠道组织发生脂质过氧化损伤及酸中毒损伤，与常规补液组比较，限制补液组能显著改善上述改变（P<0.05），见表1。

表1 不同液体复苏方式治疗60分钟时血浆MDA含量、BE值、LPS 含量±s）

表1 不同液体复苏方式治疗60分钟时血浆MDA含量、BE值、LPS 含量±s）

注：与假休克组、休克未治疗组比较，*P<0.05；与常规补液组比较，#P<0.05

组别假休克组限制补液组常规补液组休克未治疗组LPS（EU/mL）0.178±0.028 0.467±0.066#0.788±0.076*1.535±0.123血压（mmHg）90~120 60~70 90~120 45~55 MDA（nmol/L）13.07±0.32 12.03±0.61#15.40±0.54*24.07±0.92 BE（mmol/L）-0.41±2.53-1.41±2.19#-3.41±3.21*-5.41±3.35

（2）光镜下见：假休克组小肠绒毛结构正常；休克未治疗组小肠绒毛结构严重破坏，局部组织坏死脱落，黏膜厚度及绒毛高度明显降低，黏膜下层血管扩张充血、大量炎性细胞浸润；常规补液组及限制补液组均可见小肠绒毛结构基本正常，小肠部分绒毛及黏膜下层疏松水肿，炎性细胞浸润，有少量渗出物，与常规补液组比较，限制补液组小肠黏膜厚度及绒毛高度变化较小（P<0.05），见表 2。

1.3 实验讨论

通过实验，使学生掌握了科研设计的基本原则和科研工作的基本思路。失血性休克是创伤及外科手术中较常见的合并症，肠道是失血性休克后损伤的重要靶器官，肠道可发生细菌易位[2]。易位的细菌产生大量的内毒素（LPS）并释放至血液，发生内毒素血症，并激活炎症细胞，进一步加剧炎症反应，因此肠道又是SIRS（全身炎症反应综合征）的启动器官。近年来，肠I/R损伤发生及防治措施的研究越来越受到重视，但其发生机制目前尚不完全清楚。在本实验中，小肠黏膜承受失血性休克低灌注、缺氧产生酸中毒及输液后肠I/R三重损伤，可导致肠黏膜通透性增加、屏障破坏、自由基损伤，不仅如此，休克时肠道屏障功能下降，肠道炎症反应在休克复苏后仍可持续存在，也是发生MODS的重要原因。而休克复苏过程治疗不当在一定程度上加重I/R损伤。已有大量证据表明，氧自由基损伤是早期缺血再灌注损伤的重要机制[3]。因此，休克发生后，减少肠黏膜缺血再灌注导致的氧自由基损伤，保护肠黏膜屏障是减少SIRS发生及阻止休克患者转化为MODS的关键。本实验结果显示，限制性液体复苏治疗可减少氧自由基、内毒素的产生及减轻黏膜屏障的损伤程度。本实验探讨了不同治疗措施与继发SIRS及MODS之间的关系，为减少失血性休克MODS发生及预后提供一定的理论和实验依据。

表2 不同液体复苏治疗120分钟时肠道黏膜损伤情况（±s）

表2 不同液体复苏治疗120分钟时肠道黏膜损伤情况（±s）

注：与假休克组、休克未治疗组比较，*P<0.05；与常规补液组比较，#P<0.05

组别假休克组限制补液组常规补液组休克未治疗组绒毛高度（μm）412.4±10.7 338.6±11.4#230.2±17.1*138.3±11.3血压（mmHg）90~120 90~120 90~120 90~120肠 MDA（nmol/mg）0.833±0.112 2.682±0.176#4.553±0.526*7.029±0.271黏膜厚度（μm）515.7±13.5 461.5±10.7#420.1±12.3*326.2±15.5

2 学生自主实验设计的效果评价和体会

（1）通过开设创新性的综合设计性实验，加强了学生对理论知识的学习、理解和记忆，使学生对病理生理学理论和实验课产生了浓厚的兴趣，对课堂上所学的休克、酸碱紊乱、缺血再灌注的机理及对机体的相互影响有了更深入具体的研究，并使学生掌握了通过网络查阅相关知识的技能，提高了发现问题、分析问题、解决问题的能力，由被动上课转为了主动学习[4]。

（2）对教师的实验教学能力提出了新的挑战。学生的综合设计性实验要求教师不断更新知识结构，探索和帮助学生完善实验方案，引导学生正确进行实验操作，顺利完成实验报告的撰写与答辩。

（3）提高了学习兴趣，为学生终身学习奠定了基础。通过实验，使学生经历了一次初步进行科学研究的实践，使之在大学时代就能感悟到科学研究的严谨与艰苦，不仅磨炼了意志、发散了思维，还提高了其学习积极性和主动性，为学生今后从事临床工作及科学研究工作奠定了良好的基础。