腺苷对实验性股动脉狭窄远段微细血管的影响

王佳惠 史树堂△ 鲍红图 郑立双 郗 昕

(河北大学, 1 医学院形态学系, 2 附属医院实验中心, 保定 071000)

临床上为提高冠心病早期潜在心肌缺血的检出能力常使用药物负荷试验[1]。腺苷作为一种血管扩张剂,在国外已广泛应用于冠心病的诊断及预后评价[2-3]。下肢动脉狭窄疾病是临床上困扰医生多年的难题,早发现早治疗是预防狭窄疾病发生的第一步[4]。病变初期血管造影时,血管可见度差或未显示,临床不能进行正确诊断。本研究利用腺苷可与其受体结合调节血管的舒张和收缩程度来模拟肢体运动后血管扩张的过程,通过模拟股动脉狭窄,观察腺苷对股动脉狭窄远段的微细血管的影响，从而为动脉早期狭窄病变提供一种新的诊断思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选择健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,体质量(200～250) g。由河北医科大学实验动物中心提供,合格证编号1706274,饲养环境安静,室温20℃～28℃,自然照明。

1.2 主要试剂

腺苷(美国Sigma公司);1%戊巴比妥钠、Adora2a (A2a)兔多抗 (Proteintech公司);免疫组织化学试剂盒SP-9001、DAB显色剂(中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 实验方法

1%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉,将大鼠固定于带有电热板的动物台上,温度探头插入肛门内约3cm,维持体温在35℃～37℃。实验组沿腹股沟韧带中点至内踝切开皮肤,分离股动静脉,选取长度40mm、直径0.3mm去尖的针灸针与股动脉并排放置,然后紧邻腹股沟韧带的下方用手术线结扎股动脉,结扎完成后抽出针头,多普勒超声检测结扎造模后股动脉血流,若血流能逐渐恢复至结扎前水平,则股动脉狭窄造模成功。对照组仅做股动-静脉分离不结扎。分离股四头肌,使其表面没有脂肪组织,以便于观察。随后用注射泵于尾静脉持续注射腺苷(0.66mg·kg-1·min-1)。

1.4 观察指标

1.4.1 光学微血管造影(optical microangiography, OMAG)观察 2组大鼠分别在尾静脉注射腺苷第0、4、8、12分钟时用OMAG观察股动脉狭窄远段血流量的变化,实验数据用Image J进行图像处理。

1.4.2 双光子荧光显微镜(two-photon excited fluorescence microscopy, 2-photon)观察 2组大鼠分别在尾静脉注射腺苷,第0、8分钟时用2-photon观察股四头肌的毛细血管数量的变化,实验数据用Imaris进行图像处理。

1.4.3 免疫组织化学检测股四头肌内血管A2a的表达含量 给药8min后快速分离出股四头肌浸入中性福尔马林中固定24h,石蜡包埋、切片,厚度6μm。常规免疫组织化学显色，高倍镜下采集视野,取10张切片,每张观察5个视野,以阳性率平均值作统计分析。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠股动脉狭窄远段血流量的变化

实验组股动脉狭窄远段血流量在给腺苷后开始下降,并在8min时达到最小值,8min后血流量开始回升(P<0.05);对照组股动脉血流量在给腺苷后并没有出现明显差别(P>0.05)(图1)。

2.2 大鼠股动脉狭窄远段毛细血管数量的变化

实验组给腺苷8min后股四头肌的毛细血管数量明显低于给药前(P<0.05);对照组股四头肌毛细血管数量在给药前后并没有显著区别(P>0.05)(图2)。

2.3 大鼠股动脉狭窄部位A2a受体的表达

实验组股动脉结扎部位远段A2a受体表达的阳性率明显低于对照组(P<0.05)(图3)。

图1 股动脉狭窄远段血流量的变化。实验组腺苷注入0min (A)、4min (B)、8min (C)和12min (D)；对照组(E).图2 股动脉狭窄远段毛细血管数量。实验组注入腺苷0min (A)、8min (B)；对照组(C).图3 股动脉结扎部位远段A2a受体的表达,免疫组织化学显色,×200。实验组(A),对照组(B).

3 讨论

腺苷是体内嘌呤核苷酸代谢的中间产物,其心血管效应主要包括扩张冠脉血管抑制交感神经末梢释放去甲肾上腺素及对心的负性变时性、变异性的作用[5-6]。同时腺苷也是一种血管扩张剂,可产生“动脉窃血”现象,缺血区与非缺血区的血流分布差异进一步增大,对比更加明显[7]。腺苷在体内发挥的生物学效应主要是通过结合腺苷受体而产生的。腺苷受体是一种G蛋白偶联的受体,分为4种,即A1、A2a、A2b和A3[8]。腺苷与A2a的结合能活化腺苷环化酶(AC),增加第二信使环磷酸腺苷(cAMP)的浓度,激活蛋白激酶A(PKA),进一步调节细胞功能[9]。另外,腺苷与腺苷受体A2a的结合还可以调节血管的舒张[10]。因此在利用腺苷复制肢体运动后肢体血管扩张的实验中,通过观察腺苷A2a受体在血管狭窄与否中表达的含量可以间接反映血管的舒张情况。

本研究结果显示腺苷对正常血管远段的影响较小,而狭窄血管远段的微细血管数量和血流量在给药前后均有明显的差异,腺苷A2a受体在实验组的表达也远低于对照组,这与国外一些作者的研究结果一致[11]。因此，腺苷负荷试验可作为动脉狭窄诊断的辅助手段。