两种不同去污剂制备肺去细胞支架的对比❋

虞 青 吴 和 陈 婵 徐恩盼 叶晓婷 王志翊△

(温州医科大学, 1 附属第二医院急诊科, 2 附属第一医院老年医学科, 3 第二临床医学院临床医学系, 温州 325027)

目前,肺纤维化、矽肺等终末期肺部疾病临床上仍缺乏疗效确切的药物,惟一有效的治疗手段是肺移植[1]。供体器官的极度短缺已成为制约器官移植发展的主要问题,在肺移植中尤为突出。随着组织工程的发展,肺组织工程如生物人工肺和器官重建为终末期肺部疾病患者的肺移植提供了一条新的器官来源路径。生物人工肺和器官重建是基于种子细胞在天然或合成的三维支架材料中生长,其中支架材料的选择是至关重要的环节。近年来,研究人员利用去细胞技术已成功制备心、肺、肾等去细胞生物支架[2-6],所获生物支架材料,因具有生物相容性好,无免疫排斥反应等优点被广泛应用于组织工程研究领域[7]。但不同去污剂在去细胞过程中对器官组织结构的损坏程度不一,本研究对比十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)、脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate, SD)2种常用去污剂在制备肺去细胞支架中的作用及效果,为制备理想的肺生物支架材料提供方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠20 只,体质量(230±20) g,购自温州医科大学实验动物中心,SPF级无菌环境饲养,动物生产许可证号： SCXK(浙)2010-0044。

1.2 主要试剂

十二烷基磺酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠(Sigma公司)；青霉素-链霉素抗生素混合液(上海博蕴生物有限公司);DNA检测试剂盒(美国Omega公司);Masson三色染色试剂盒(Solarbio公司);兔抗胶原IV蛋白抗体、层黏连蛋白(laminin, LN)抗体、纤维连接蛋白抗体(fibronectin, FN)。

1.3 动物分组和处理

30只SD大鼠按随机数字表法分成去细胞组SDS、脱氧胆酸钠与正常对照组,每组10只。对照组SD大鼠按0.3ml/100g 10%水合氯醛行腹腔注射麻醉,全麻后打开胸腔,分离出下腔静脉,从下腔静脉注射肝素1.5ml,行全身肝素化处理,分离切取新鲜全肺和心联合体。去细胞组在正常对照组基础上,采用去细胞技术制备全肺去细胞支架。

1.4 肺去细胞生物支架制备

根据参考文献[8-9] ,20G留置针从心肺联合体右心室插入肺动脉,置管至肺主动脉后结扎固定,肝素PBS灌注冲洗肺残留血液至肺呈白色,1% Triton X-100 灌注1h。去细胞SDS组采用0.8%SDS灌注法,最后去离子水灌注6h,整个灌注过程恒温37℃,灌注压控制在8mmHg以内,灌注液流速约8ml/min。去细胞脱氧胆酸钠组以0.8%脱氧胆酸钠代替SDS,按照相同流程灌注。灌注过程中观察各时间点肺颜色及形态的变化,将制备的肺去细胞生物支架用 PBS冲洗干净, 4℃含抗生素PBS保存备用。

1.5 去细胞全肺生物支架的观察与鉴定方法

1.5.1 肺组织大体观察 观察各组肺组织的颜色及形态变化。

1.5.2 电镜观察 正常对照组及去细胞组肺组织经2.5%戊二醛4℃固定24h,固定组织洗用生理盐水清洗3次,每次15min,用梯度乙醇溶液脱水(70%、80%、90%、100%),脱水后的样品移入临界点CO2干燥机进行干燥处理。样品在15kV扫描电子显微镜(S3000-N, Hitachi)。

1.5.3 DNA含量分析 分别切取正常对照组与去细胞组肺组织约100mg,经匀浆、细胞裂解、去蛋白及纯化后,提取基因组DNA (参照DNA试剂盒说明操作),紫外分光光度计测定其浓度。

1.5.4 H-E染色 正常对照组及去细胞组肺组织经4%多聚甲醛固定,酒精梯度脱水、二甲苯透明石蜡包埋、切片,常规H-E染色后光镜下观察。

1.5.5 Masson染色 组织切片按照试剂盒说明进行染色,光镜下观察。

1.5.6 免疫荧光染色 对各组肺组织FN、 LN蛋白进行免疫荧光染色,具体参考试剂说明书操作,荧光显微镜下观察各组肺组织FN、 LN蛋白表达情况。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 大体观察

正常对照组肺呈乳白色;两组去细胞组肺在灌注过程中逐渐由外至内变白,且逐渐变半透明,灌注完毕全肺变为乳白色半透明状,肉眼可清晰观察到肺内管道大体分支形态,去细胞SDS组有较多明显清晰的管道(图1，见封三)。

2.2 扫描电镜观察

去细胞SDS组扫描电镜下显示结果未见明显不同,且仍有明显且完整的肺泡结构,去细胞脱氧胆酸钠组有肺泡结构存在轻微破坏(图2，见封三)。

2.3 基因组DNA含量分析

两组去细胞组肺支架DNA含量显著低于正常对照组肺组织(P<0.01);去细胞SDS组DNA去除率超过95%,去细胞脱氧胆酸钠组去除率约94%;两实验组提取的DNA标本A260/ A280比值均在1.8～2.0,标本DNA纯度较高(表1)。

2.4 H-E染色观察

H-E染色显示正常对照组肺组织结构呈网格状分布,细胞核清晰;去细胞SDS组肺支架仅可见网格状结构,支架上未见残存细胞及细胞核等结构,去细胞脱氧胆酸钠组肺支架可见网格状结构上附有残存细胞核碎片(图3，见封三)。

表1 各组肺组织DNA含量测定±s， n=10)

*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsSDS group

2.5 Masson染色

Masson染色显示正常对照组肺组织较去细胞实验组有更多呈网格状分布的弹性纤维,去细胞SDS组有更多弹性蛋白残留且构架完整,去细胞脱氧胆酸钠组有轻度破坏(图4，见封三)。

2.6 免疫荧光观察

对照组层黏连蛋白、纤维蛋白主要表达于系膜、基膜及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)中,两组网格状结构有没有破坏,去细胞SDS组完整,去细胞脱氧胆酸钠组轻微破坏(图5，见封三);纤维连接蛋白呈完整红色网格状,去细胞SDS组着色度高,去细胞脱氧胆酸钠组着色度低(图6，见封三)。

3 讨论

去细胞生物支架制备技术主要是通过酶学法和化学法浸泡、灌注组织器官,去除组织器官实质细胞及可溶性蛋白成分,保留其不溶性ECM如弹性蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、层黏连蛋白等。目前,常用的去细胞方法是通过胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶等酶消化水解,联合Trition X-100、SDS、脱氧胆酸钠等化学去垢剂灌注组织器官[10-11]。其中胰蛋白酶的主要作用是水解组织细胞间的蛋白质,从而使细胞离散。但有研究报道,胰蛋白酶可水解弹性蛋白和胶原蛋白,对组织ECM结构破坏严重[11],而胶原和弹性蛋白是决定肺基质力学性能的最主要成分。为了较好地保留肺组织ECM成分,本研究未使用胰蛋白酶。1%的Triton X-100一种比较温和的去垢剂,常用于漂洗组织标本,同时能有效去除较厚组织的细胞[12]。在去细胞生物工程研究中,离子型去污剂SDS和脱氧胆酸钠的使用被认为能减轻ECM超微结构的破坏[13],且已作为常规去细胞试剂应用于各种器官去细胞支架制备[14]。脱氧胆酸钠常用于脊髓、胰等各类器官去细胞支架的制备,去细胞效果较为良好[15]。但本研究结果显示,在肺去细胞过程中,脱氧胆酸钠对肺组织的结构破坏较大,而SDS对肺组织的结构破坏则不明显,能较好地保留肺组织ECM成分。

本课题组制备的全肺去细胞支架经Masson染色、免疫荧光染色等鉴定,结果表明2种试剂均能较完全地去除肺组织细胞及细胞核结构,同时保留ECM主要成分层黏连蛋白与纤维连接蛋白,但SDS灌注组制备的支架结构完整性更高、延展性更好。去细胞支架中较为完整的肺泡结构有利于细胞的附着,提供近似天然的肺构架,有利于组织构建及恢复[16]。研究表明,去细胞支架残留DNA浓度小于50ng/mg(干重)且H-E染色未见明显细胞核结构,移植在生物体内能避免免疫排斥反应[17]。本研究结果显示去细胞SDS组支架DNA含量明显小于去细胞脱氧胆酸钠灌注组,且低于避免免疫排斥反应的DNA含量标准,可见采用SDS灌注制备的去细胞支架生物组织相容性更强,有利于后续肺细胞植入、再生方面实验研究的开展[18-19]。

本研究通过灌注法,对比SDS、脱氧胆酸钠两种化学去污剂制备的肺去细胞支架,结果表明SDS组灌注制备的肺生物支架在组织结构完整性、DNA残留量等方面均优于脱氧胆酸钠组,是一种较理想的制备组织工程肺生物支架材料的化学去污剂。

图版说明(图见封三)

图1 全肺大体观察。A： 新鲜正常心肺组织,呈乳白色;B： SDS组支架,呈乳白色半透明,管道明显;C： 脱氧胆酸钠组支架,呈乳白色半透明,管道较少.

图2 扫描电镜结果。A： 正常对照组,肺泡结构清晰完整; B： 去细胞SDS组,肺泡结构清晰完整;C： 去细胞脱氧胆酸钠组,肺泡结构轻微破坏.

图3 肺组织病理学H-E染色,×200。A： 正常对照组,肺泡结构完整,组织布满蓝色细胞核; B： 去细胞SDS组,肺去细胞支架呈网格状结构,支架上无细胞及细胞核等结构; C： 去细胞脱氧胆酸钠组,肺去细胞支架呈网格状结构,呈粉蓝色,无细胞及细胞核等结构.

图4 肺组织病理学Masson染色,×200。A： 正常对照组,肺泡结构完整,蓝色网状结构上布满紫红色细胞核,弹性蛋白丰富; B： 去细胞SDS组,去细胞支架呈蓝色网状,无紫红色细胞核残留; C： 去细胞脱氧胆酸钠组,去细胞支架呈蓝色网状,有紫红色细胞核残留.

图5 层黏连蛋白免疫染色,×200。A： 正常对照组,层黏连蛋白呈阳性; B： 去细胞SDS组,层黏连蛋白呈阳性;C： 去细胞脱氧胆酸钠组,层黏连蛋白呈阳性,着色度低,含量少.

图6 纤维蛋白免疫染色,×200。A： 正常对照组,纤维连接蛋白呈阳性; B： 去细胞SDS组,纤维连接蛋白呈阳性;C： 去细胞脱氧胆酸钠组,纤维连接蛋白呈阳性,着色度低,含量少.

Explanation offigures(See inside back cover)

Fig 1 Visual observation. A： Fresh normal lung tissues were milky white; B： SDS group scaffold, showing milky white translucent and obvious duct; C： Sodium deoxycholate group scaffold, showing milky white translucent and less duct.

Fig 2 SEM results. A： Control group, the alveolar structure were clear and complete; B： SDS group, the alveolar structure clear and complete； C： alveolar structure were destroyed slightly in the deoxycholate sodium group.

Fig 3 Lung tissue pathological graphics H-E staining, ×200. A： Control group: the alveolar structure integrity, tissue covered with blue nuclei; B： SDS group: lung acellular scaffold was grid shaped structure, and the bracket structure without cells and nuclei; C： Sodium deoxycholate group showed a grid-like structure, pink and blue without cells and nuclei.

Fig 4 Masson staining of lung tissue, ×200. A： Control group: the alveolar structure integrity, the blue reticular structure was covered with purple nucleus, and the elastic protein was rich; B： SDS group: acellular blue mesh, no red nucleus; C： Sodium deoxycholate group: the scaffolds were blue mesh with purple red nucleus residue.

Fig 5 Immunofluorescence of laminin, ×200. A： Control group, laminin positive; B： SDS group, laminin positive; C： Sodium deoxycholate group, laminin positive, coloring degree being lower and less.

Fig 6 Immunofluorescence of fibronectin, ×200. A： Control group,fibronectin positive； B： SDS group, fibronectin positive; C： Sodium deoxycholate group, fibronectin positive coloring degree being lower and less.